肝癌Hep3B细胞HLA－G过表达对NK细胞体外杀伤作用的影响*

曾宪成， 张 彤， 李 华， 方天翎， 聂常富， 陈规划△

(1增城市人民医院普通外科，广东增城511300;2中山大学附属第三医院肝移植中心，广东广州510630;3广州医学院第一附属医院肝胆外科，广东广州510120;4郑州大学附属肿瘤医院肝胆外科，河南郑州450003)

人类白细胞抗原G(human leukocyte antigen－G，HLA－G)是一种非经典的HLA－Ib类抗原，参与保护胚胎免受母体淋巴系统的攻击。它最早于1987年被 Geraghty等［1］克隆，1990 年 Kovats等［2］发现它在胎盘绒毛远端的细胞滋养层特异表达。到目前为止已发现HLA－G在人类多种恶性肿瘤中表达，HLA－G与肿瘤免疫逃逸的关系成为关注的焦点。Wang等［3］发现肝癌中表达HLA－G，并且其是影响预后的独立因素，推测HLA－G可能通过抑制NK细胞，促进肝癌复发、转移。我们在前期实验中发现肝癌细胞系中Hep3B细胞表达HLA－G最少，因此，我们选用Hep3B细胞构建HLA－G过表达模型，研究其在体外与NK细胞杀伤作用的关系。

材料和方法

1 材料

Hep3B细胞购自中科院上海细胞生物研究所，采用含10%FBS高糖DMEM培养基在37℃、5%CO2、饱和湿度的条件下培养，每3～4 d换液，70%～80%融合后0.25%胰蛋白酶消化传代。大肠杆菌DH5α由中山大学附属第三医院中心实验室保存。胎牛血清及DMEM高糖培养基均购自Gibco，dNTPs(Promega)，Taq polymerase(TaKaRa)，Plasmid Maxi Kit(Qiagen)，Xho I、Bam H I、Age I、T4 DNA ligase 和T4 DNA ligase buffer(NEB)，Lipofectamine 2000(Invitrogen)，Opti－MEM(Gibco)，RNAprep pure总 RNA提取试剂盒(北京天根)，快速凝胶回收试剂盒(O-mega)，SYBR® PrimeScriptTMRT－PCR Kit(TaKa-Ra)，小鼠抗人HLA－G单克隆抗体和小鼠抗人GAPDH单克隆抗体(Abcam)，小鼠抗人HLA－ABC单克隆抗体(Biolegend)，辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的羊抗小鼠抗体(Pierce)。

2 方法

2．1 引物设计和目的基因扩增 根据GenBank HLA－G的编码序列，用Primer Premier 5软件设计包括HLA－G全长的引物，HLA－G上游引物5’－TAATAACTCGAGATATGGTGGTCATGGCA－3’，下游引物5’－TAATAAGGATCCCTAATCTGAGCTCTTCTTCC －3’，扩增片段为1 017 bp，引物由上海英骏公司合成。以含有待扩增序列的DNA为模板进行PCR扩增，50μL反应总体积中加入下列物质:H2O 38 μL、10 × Pfx Buffer、10 mmol/L dNTPs 1.5 μL、50 mmol/L MgSO4、Platinum Pfx、10 mmol/L 引物各 1.5 μL，在PCR仪上完成PCR扩增，扩增条件如下:95℃ 预变性2 min，95 ℃ 15 s，52 ℃ 15 s，68 ℃ 60 s，30个循环，68℃ 5 min。取3.5μL PCR扩增产物，1.5%琼脂糖凝胶电泳，以鉴定PCR扩增结果。

2．2 过表达载体的构建及鉴定 将上述DNA片段退火，用T4连接酶连接于经双酶切(Xho I和Bam H I)的质粒 pEGFP－C1，连接产物转化感受态细菌DH5α，接种到含50 mg/L kanamycin的 LB培养基中。使用碱裂解法抽提质粒，所得质粒用Xho I和Bam H I分别酶切鉴定。将筛选到的阳性克隆进行测序鉴定。

2．3 细胞培养与筛选 Hep3B细胞37℃、5%CO2培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液中。将处于对数生长期的细胞接种于12孔板中，至细胞密度达90%时，加入含 G418的培养液1 mL/well(G418终浓度分别为100～800 mg/L)。持续培养，2周后G418浓度≤200 mg/L各孔细胞稳定生长，而≥300 mg/L细胞孔相继全部死亡。因此，在本实验条件下G418筛选浓度为400 mg/L，维持浓度为200 mg/L。实验分为正常对照组(无干预措施，Hep3B组)、空载体对照组(转染空质粒，Hep3B－GFP组)和实验组(转染pEGFP－C1－HLA－G质粒，Hep3B－HLA－G组)。

2．4 细胞转染与筛选 2×105～3×105Hep3B细胞传入24孔板，第2 d待细胞密度达70% ～85%以上时，按Lipofectamine 2000操作手册转染。转染24 h后细胞用胰酶消化，按每孔50个细胞转移至24孔板。G418的筛选浓度维持2周后，扩大培养。

2．5 Real－time PCR检测 HLA－G mRNA表达收集上述3组细胞，用PBS洗3次，按照试剂盒操作手册提取总RNA，用紫外分光光度法定量RNA。将等量的RNA反转录为cDNA第1链。SYBR® Pri-meScriptTMRT－PCR Kit(两步法)反转录反应条件如下:37℃ 15 min，85℃ 5 s。将PCR反应液加入real－time PCR用反应管中:95℃ 10 s，1个循环;95℃5 s，60 ℃ 31 s，40 个循环;95 ℃ 15 s，60 ℃ 10 s，95℃ 15 s，1个循环。分析熔解曲线和扩增曲线，计算ΔCt值和 RQ 值(RQ=2－ΔΔCt)。

2．6 Western blotting检测HLA－G蛋白表达 分别收取3组细胞，PBS洗3次，细胞刮将细胞刮下，按照试剂盒操作手册提取总蛋白。BCA蛋白定量试剂盒对收取的各组蛋白进行定量，取等量蛋白30μg行SDS－PAGE，电泳转移至PVDF膜，脱脂奶粉封闭3 h后加小鼠抗人单抗HLA－G I抗(1∶500)放置于4℃过夜，HRP标记羊抗鼠IgG II抗(1∶100 000)与膜室温孵育1 h。PVDF膜曝光60～90 s后胶片放入全自动X片冲洗机完成显影、定影，干燥等。Bio－Rad全自动扫描仪扫描胶片，Quantity One软件分析结果。

2．7 细胞毒性检测 (1)实验分组为空白组、靶对照组、效应对照组、实验组。(2)实验组包括未封闭组和封闭组。封闭组:选生长良好的Hep3B、Hep3B－GFP和Hep3B－HLA－G细胞，每瓶均加入小鼠抗人 HLA －ABC 抗体(终浓度5 mg/L)［4］，于37℃、5%CO2培养箱中培养箱中培养24 h。未封闭组:为正常培养Hep3B、Hep3B－GFP和Hep3B－HLA－G细胞，未用小鼠抗人HLA－ABC抗体封闭。外周血单个核细胞的活性检测法参照孙卫民等［5］的方法计数细胞，调整靶细胞浓度为1×108/L，效应细胞浓度为1×109/L，效靶比(效应细胞∶靶细胞)10∶1。每组均各设3个复孔。(3)计算方法:杀瘤活性(%)=1－(效应组－对照组)/(靶对照组－空白对照组)×100%。

3 统计学处理

应用SPSS15.0统计分析软件，数据以均数±标准差(¯x±s)表示，多个样本均数比较应用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 PCR扩增目的基因

PCR扩增目的基因产物经琼脂糖凝胶电泳分析，在约1 017 bp处有一特异性扩增条带，与预期的大小片段一致，见图1。

2 HLA－G过表达质粒酶切鉴定

将pEGFP－C1－HLA－G进行双酶切，回收目的片段，并与表达载体连接。对PCR检测阳性的克隆抽提质粒DNA。PCR产物得到了1 017 bp的目的片段和约4 731 bp的载体片段，结果表明HLA－G成功地构建到pEGFP－C1表达载体中，见图2。

Figure 1．Identification of PCR product of HLA－G gene by agarose gel electrophoresis．1，2:PCR product of HLA － G gene;3:marker．图1 HLA－G基因PCR产物鉴定电泳图

Figure 2．Agarose gel electrophoretic profile of recombinant expression plasmids digested by restrict endonucleases．1:the pEGFP－C1 plasmid digestion by Bam H I and Xho I(4 731 bp);2～7:the pEGFP－C1－HLA－G plasmid digested by Bam H I and Xho I(pEGFP－C1 is 4 731 bp and HLA－G is 1 017 bp);8:the pEGFP－C1－HLA－G plasmid without digestion(5 748 bp);9:marker．图2 p EGFP－C1－HLA－G质粒酶切鉴定电泳图

3 HLA－G过表达质粒测序鉴定

对初步鉴定为阳性的克隆提取质粒。重组质粒测序结果表明:插入片段与设计的HLA－G核苷酸序列完全一致，插入序列方向、位置及大小均正确，未发现有突变、缺失、插入等异常存在，表明已经成功地构建针对HLA－G基因的过表达质粒，见图3。

4 稳定转染

转染24 h后即有绿色荧光表达，转染48 h后表达效率最高。经G418筛选浓度维持2周后，挑取阳性克隆，进行扩大培养后，建立稳定转染的Hep3B细胞系。荧光显微镜检测发现，该细胞发出较强的绿色荧光，提示获得了稳定表达 HLA－G的Hep3B细胞系，见图4。

Figure 3．Sequencing result of pEGFP－C1－HLA－G plasmid．图3 pEGFP－C1－HLA－G质粒的测序结果

Figure 4．Fluorescence microscope detection showed that pEGFP－C1 and pEGFP－C1－HLA－G were stably transfected into Hep3B cells(×100)．A:Hep3BGFP(phase－contrast);B:Hep3B－GFP(fluorescence);C:Hep3B－HLA－G(phase－contrast);D:Hep3B－HLA－G(fluorescence)．图4 荧光显微镜检测稳定转染pEGFP－C1和pEGFPC1－HLA－G的Hep3B细胞

5 重组质粒转染的Hep3B细胞后HLA－G mRNA的表达

Real－time PCR检测 Hep3B、Hep3B－GFP和Hep3B－HLA－G各组 ΔCt值分别为0.00003±0.00000、0.00002±0.00000和0.00542±0.00149。其中Hep3B和Hep3B－GFP两组RQ值差异无统计学意义(P＞0.05)，Hep3B－HLA－G组与前两组相比，RQ值差异有统计学意义(P＜0.01)，mRNA水平表达上调约180倍，见图5。

6 重组质粒转染的Hep3B细胞HLA－G蛋白的表达

Hep3B、Hep3B－GFP和Hep3B －HLA－G各组Western blotting结果显示，HLA－G/β－actin吸光度比值分别为0.5698±0.1648、0.4748±0.1538和6.1188±0.1199，其中Hep3B和Hep3B－GFP两组吸光度比值差异无统计学意义(P＞0.05)，Hep3B－HLA－G与前两组相比，吸光度比值差异有统计学意义(P＜0.01)，蛋白水平HLA－G表达上调约10倍，见图6。

Figure 5．The mRNA expression of HLA －G detected by realtime PCR．¯x±s．n=3．＊＊P＜0.01 vs Hep3B and Hep3B －GFP．图5 Real－time PCR检测各组HLA－G mRNA水平的变化

7 NK细胞杀伤活性的测定

NK细胞对 Hep3B、Hep3B－GFP和 Hep3BHLA－G细胞的杀伤率见图7。未封闭HLA－ABC靶位点时，NK细胞对Hep3B组和Hep3B－GFP组杀伤率差异无统计学意义(P＞0.05);与前两组相比，NK细胞对Hep3B－HLA－G组的杀伤明显下降(P＜0.01)。封闭HLA－ABC靶位点后，NK细胞对靶细胞的杀伤较前均明显增加(P＜0.01)，NK细胞对Hep3B(封闭)组和Hep3B－GFP(封闭)组的杀伤率无统计学差异(P＞0.05);与前两组相比，NK细胞对Hep3B－HLA－G(封闭)组的杀伤明显下降(P＜0.01)。

讨 论

Figure 6．The relative protein expression of HLA－G detected by Western blotting．¯x±s．n=3．＊＊P＜0.01 vs Hep3B and Hep3B－GFP．图6 Western blotting检测各组HLA－G蛋白的表达

Figure 7．In vitro cell－killing effect of NK cells on Hep3B cells in different groups．¯x±s．n=6．＊＊P＜0.01 vs Hep3B and Hep3B－GFP;△△P＜0.01 vs Hep3BHLA－G;##P＜0.01 vs Hep3B(block)and Hep3B－GFP(block)．图7 NK细胞对不同处理组肝癌Hep3B细胞的杀伤作用

HLA－G定位于6号染色体短臂HLA远端300 bp以内，其由膜结合性重链和信号肽以非共价形式结合，重链需要与β2微球蛋白(β2－microglobulin，β2M)联合才能与HLA－G配体结合［3］，并发挥生物作用。蛋白结构分析表明，膜结合性重链包含3种免疫球蛋白样结构域(α1～α3)，其中α1和α2结构域由数个肽结合区组成。由于有限的基因多态性，到目前为止，从胎盘源生HLA－G分子中仅分离鉴定出3种肽分子［6－7］。HLA－G具有抑制免疫细胞的功能，其能抑制NK细胞和CTL细胞介导的细胞裂解以及T细胞增殖反应［8］。近年来发现在多种恶性肿瘤细胞中检测到HLA－G，它在肿瘤细胞中的异常表达同样被认为可能是肿瘤细胞得以逃避宿主免疫监视的手段［9－11］。

本研究经过PCR、双酶切及测序鉴定，表明插入片段与设计相符，成功构建pEGFP－C1－HLAG过表达载体。通过Lipofectamine 2000介导转染到肝癌Hep3B细胞，24 h后即有绿色荧光蛋白的表达，48 h后最强，经过G418筛选，成功建立稳定表达HLA－G的肝癌Hep3B细胞株。经real－time PCR检测证实，稳定转染后Hep3B－HLA－G组HLA－G mRNA水平上调约180倍，差异显著(P＜0.01)。通过 Western blotting检测稳定转染后Hep3B－HLA－G组HLA－G蛋白表达上调约10倍，显著差异(P＜0.01)。目地基因在mRNA及蛋白水平上调并不一致，在以往文献中也有类似报道［12］，我们推测可能的原因有:(1)pEGFP－C1表达载体采用CMV启动子，可以高效促进外源性HLA－G基因转录;(2)HLA－G蛋白表达可能受转录后调控影响，蛋白质经过修饰、折叠、磷酸化及脱磷酸化都影响其抗原性，针对同一种蛋白质的不同抗原形式，需要不同的抗体检测。与NK细胞共培养，观察到NK细胞对HLA－G过表达细胞细胞杀伤作用显著减弱，进一步说明HLA－G可能是肝癌免疫逃逸的重要机制之一，HLA－G上调表达可以削弱NK细胞的免疫监视功能。

近年来发现NK细胞主要通过“丢失自我”机制启动杀瘤效应，肿瘤细胞在丢失或变构HLA－A、HLA－B和HLA－C的同时可高表达非经典MHC－Ⅰ类分子(如 HLA－G、HLA－E)，传递强烈的杀伤抑制信号，致使肿瘤细胞在逃逸细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte，CTL)的杀伤作用后又逃逸NK细胞的杀伤作用。这在我们的研究中得到证实，抗体封闭肝癌Hep3B、Hep3B－GFP和Hep3BHLA－G细胞HLA－ABC靶位点时，NK细胞对其杀伤均明显增强。这提示当靶细胞表面经典MHC－Ⅰ类分子表达下调后，NK细胞才能启动对其杀伤。我们在HLA－E基因观察到了相似的结果［13］，其确切机制目前尚不明确。我们推测，抗体封闭了靶细胞表面经典MHC－Ⅰ类分子，使NK细胞的部分杀伤抑制性受体不能识别其配体而阻断了负性信号的转导，导致了NK细胞对这些靶细胞杀伤活性的增强。有文献报道，HLA－G可与以下ILT－2、ILT －4、KIR2DL4 等［14－15］受体结合，向 NK 细胞传递抑制性信号，但究竟通过何种途径引发一系列下游事件，从而使得NK细胞发生改变，仍需要进一步研究。

综上所述，本实验成功构建HLA－G过表达载体，特异性上调HLA－G表达，成功建立HLA－G过表达细胞模型，并证实HLA－G可以削弱NK细胞免疫监视功能，为进一步研究HLA－G的功能及其在肝癌免疫逃逸中的作用及机制奠定了实验基础。

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