高效液相色谱法测定稳心颗粒中非法添加药物的含量

张士勇，程 军，叶 云

(安徽省蚌埠市第三人民医院药事办，安徽 蚌埠 233000)

稳心颗粒质量标准收载于《国家药品标准·新药转正标准(第 23 册)》[WS3-205(X-029)-99(Z)]，是由党参、三七、甘松等药味经加工制成的颗粒。由于原稳心颗粒质量标准中未列入非法添加抗心律失常类化学药物的检查和含量测定方法，且原稳心颗粒补充检验方法建立时间较早(2003015)，仅检测样品中非法添加的盐酸普罗帕酮。近年来，抗心律失常类化学药物盐酸普萘洛尔、盐酸维拉帕米、盐酸普罗帕酮等[1-3]原料药物购买容易，可能被不法分子添加到稳心颗粒等同类中成药中，对患者的用药安全构成极大威胁。因此，有必要建立目前较普及的高效液相色谱法，检测样品中盐酸普萘洛尔、盐酸维拉帕米、盐酸普罗帕酮等化学药物的含量。

1 仪器与试药

Shimadzu LC-20A型全自动高效液相色谱仪;AE240型电子天平(瑞士Mettler)。盐酸普萘洛尔、盐酸维拉帕米对照品(中国药品生物制品检定所，批号分别为 100783-200401，100223-200102);盐酸普罗帕酮对照品(Sigma-Alorich，068K1558，5G，USA)，由上海安谱科学仪器有限公司提供。试验中所用甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯;水为重蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Inertsil ODS-SPC18柱(250 mm×4.6 mm，5μm);流动相:磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾6.8 g，辛烷磺酸钠1.3 g，加水溶解并稀释至1 000 mL，用磷酸调节pH至3.0)-甲醇(40∶60);柱温:25℃;流速:0.8 mL/min;检测波长:223 nm;进样量:10μL。

2.2 溶液制备

取盐酸普萘洛尔、盐酸维拉帕米、盐酸普罗帕酮对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含盐酸普萘洛尔、盐酸维拉帕米、盐酸普罗帕酮各25μg的溶液，即得对照品溶液。取本品内容物，研细，取约0.5 g，精密称定，置三角烧瓶中，精密加入甲醇50.0 mL，密塞，称定质量，超声处理(功率500 w，频率40 kHz)20 min，放冷，再称定质量，加甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。取供试品溶液适量，加入一定体积的3种对照品贮备液，摇匀，即得含3种对照品的供试品溶液。

2.3 方法学考察

系统适用性试验:取盐酸普萘洛尔、盐酸维拉帕米、盐酸普罗帕酮混合对照品溶液，注入液相色谱仪中，结果3种对照品理论板数均大于5 000，分离度均大于1.5，拖尾因子均介于0.95～1.05之间，重复性试验 RSD均小于1.5%，符合药典规定。高效液相色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

标准曲线绘制:分别精密称取盐酸普萘洛尔、盐酸维拉帕米和盐酸普罗帕酮对照品24.70，25.00，24.87 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇使溶解，定容。再分别精密吸取1.0 mL，置10 mL量瓶中，摇匀，制成每1 mL含盐酸普萘洛尔0.247 mg、盐酸维拉帕米0.25 mg和盐酸普罗帕酮0.248 7 mg的溶液，作为对照品贮备液。分别精密吸取对照品贮备液，加甲醇制成系列质量浓度的混合对照品溶液。再分别吸取系列浓度的混合对照品溶液各10μL，注入液相色谱仪，依法测定，记录色谱图，计算峰面积积分值 A，以进样量 C(μg)为横坐标、峰面积积分 A均值为纵坐标，得回归方程，盐酸普萘洛尔 A=8×106C-27 393，r=1(n=8);盐酸维拉帕米 A=2×106C-8 214.7，r=1(n=8)、盐酸普罗帕酮 A=2×106C-5 820.1，r=1(n=8)。结果表明，盐酸普萘洛尔、盐酸维拉帕米和盐酸普罗帕酮进样量分别在0.019 76～2.47μg，0.01～2.5μg和0.009 948～2.487μg范围内与峰面积积分均值有良好线性关系。

精密度试验:精密吸取1份混合对照品溶液10μL，重复进样6次。结果盐酸普萘洛尔、盐酸维拉帕米和盐酸普罗帕酮峰面积的 RSD分别为0.09%，0.20%和0.21%(n=6)，表明仪器精密度良好。

稳定性试验:取同一供试品溶液，室温下放置，分别于0，1，2，3，18 h时在上述色谱条件下测定。结果盐酸普萘洛尔、盐酸维拉帕米和盐酸普罗帕酮峰面积的 RSD分别为0.22%，0.28%和0.18%(n=5)，表明供试品溶液在18 h内稳定性较好。

加样回收试验:取同一批号不含盐酸普萘洛尔、盐酸维拉帕米和盐酸普罗帕酮的稳心颗粒样品6份，每份约0.5 g，精密称定。分别精密加入每1 mL含盐酸普萘洛尔2.717 mg、盐酸维拉帕米2.75 mg和盐酸普罗帕酮2.735 7 mg的混合对照品溶液1.0 mL，置三角烧瓶中，再精密加入甲醇24.0 mL，依法制成供试品溶液。精密吸取每1 mL含盐酸普萘洛尔2.47 mg、盐酸维拉帕米2.5 mg和盐酸普罗帕酮2.487 mg的混合对照品溶液1.0 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为对照品溶液。分别吸取供试品溶液和对照品溶液各5μL，注入液相色谱仪，依法测定，计算回收率。结果盐酸普萘洛尔、盐酸维拉帕米和盐酸普罗帕酮的平均回收率分别为97.11%，97.63%，98.88%，RSD分别为1.85%，1.92%，1.46%(n=6)。结果表明，方法的准确性较好。

2.4 样品含量测定

按照上述拟订的方法，对山东步长制药有限公司生产的3批稳心颗粒样品(批号分别为090335，100803，100812)进行测定，结果未检出盐酸普萘洛尔、盐酸维拉帕米和盐酸普罗帕酮。

3 讨论

在上述色谱条件下，分别精密吸取各对照品溶液10μL，注入液相色谱仪，各色谱峰用PDA检测器在190～400 nm波长范围内进行光谱扫描，结果盐酸普萘洛尔的最大吸收波长为214.5，289.0 nm;盐酸维拉帕米的最大吸收波长为230.1 nm;盐酸普罗帕酮的最大吸收波长为247.9 nm、但盐酸普萘洛尔、盐酸维拉帕米、盐酸普罗帕酮在223 nm波长处均有较大吸收值，故选择223 nm作为其液相色谱检测波长。

盐酸普萘洛尔、盐酸维拉帕米和盐酸普罗帕酮在甲醇中均易溶或溶解，均比在水中溶解度更好，故选择甲醇作为供试品的提取溶剂。

试验中参照文献[4-10]，分别用流动相为不同比例的0.02 mol/L磷酸二氢钠-甲醇、0.02 mol/L磷酸二氢钠-甲醇-乙腈、甲醇-水-冰醋酸-三乙胺、甲醇-0.1%冰醋酸进样测定。试验结果表明，选用不同比例的0.02 mol/L磷酸二氢钠-甲醇、0.02 mol/L磷酸二氢钠-甲醇-乙腈为流动相时，盐酸普萘洛尔与盐酸普罗帕酮、盐酸维拉帕米分离度均较好，而盐酸普罗帕酮与盐酸维拉帕米保留时间相差小于1 min，分离度小于1.5，不符合《中国药典》要求，故不选其为本法流动相;选用不同比例的甲醇-水-冰醋酸-三乙胺、甲醇-0.1%冰醋酸为流动相时，盐酸维拉帕米均未出峰，故不选用其为本法流动相。选用磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾6.8 g，辛烷磺酸钠1.3 g，加水溶解并稀释至1 000 mL，用磷酸调节pH至3.0)-甲醇(40∶60)作为流动相，盐酸普萘洛尔、盐酸维拉帕米和盐酸普罗帕酮各峰峰形及分离度均较好，稳心颗粒样品在相应位置上均无干扰。

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