高效液相色谱法测定脑得生胶囊中羟基红花黄色素A含量

顾武军，陈宗良

(1.浙江省宁波市鼓楼街道社区卫生服务中心，浙江 宁波 315000;2.浙江省金华市食品药品检验所，浙江 金华 321000)

脑得生胶囊，由三七、川芎、红花、葛根、山楂5味中药材组方，具有活血化瘀、疏通经络、醒脑开窍之功效，用于治疗脑动脉硬化、缺血性脑中风和脑出血后遗症等。原质量标准[WS3-30(X-30)-2002(Z)]中未对红花有任何控制指标。而红花中含有多种黄酮类混合物，具有活血通经、祛疲止痛的功效，其中羟基红花黄色素A(HSYA)是红花的主要药效物质，是评价红花及其制剂质量的主要指标[1]。笔者建立了脑得生胶囊中HSYA的含量测定方法，为有效控制产品质量提供参考依据，现报道如下。

1 仪器与试药

Agilent 1200型高效液相色谱仪;梅特勒XS105DU型分析天平(起始0.000 00 g)。HSYA对照品(由江西本草天工科技有限公司提供，经高效液相色谱峰面积归一化法检查含量大于97%);脑得生胶囊(吉林省华威药业有限公司);水为娃哈哈纯净水，甲醇为色谱纯(默克公司)，其余为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Zorbax Eclipse XDB-C18柱(150 mm×4.6 mm，5μm);流动相:甲醇-0.5%磷酸溶液(25∶75);检测波长:403 nm[2];柱温:35℃;流速:1.0 mL/min;进样量:20μL。理论板数按HSYA峰计算大于3 000。

2.2 溶液制备

称取HSYA对照品0.052 52 g，置100 mL量瓶中，加25%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。取脑得生胶囊内容物，研细，称取约2.5 g，精密称定，精密加25%甲醇25 mL，称定质量，超声处理30 min，放冷，用25%甲醇补足减失的质量，离心，取上清液用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3 方法学考察

阴性干扰试验:取处方中除红花外的另4味药按制法制成阴性样品，按供试品溶液的制备方法制成阴性对照品溶液，并按拟订的色谱条件测定。结果在HSYA对照品峰相应的位置未见其他的干扰峰(见图1)。

线性关系考察:精密量取对照品贮备液2 mL，置50 mL量瓶中，加25%甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。再精密吸取对照品溶液 1，5，10，20，30，40 μL，分别注入液相色谱仪(每份重复进样2次)，按拟订的色谱条件测定峰面积。以峰面积为纵坐标、HSYA进样质量浓度为横坐标绘制标准曲线，得回归方程Y=2 524.7 X+72.831，r=0.999 3(n=6)。结果表明，HSYA 进样量在0.021～0.840μg范围内与峰面积呈良好线性关系。

图1 高效液相色谱图

重现性试验:分别称取同一样品6份，按2.2项下方法制备供试品溶液并测定含量。结果的 RSD=1.77%。

精密度试验:分别精密吸取对照品溶液10μL，重复进样6次。结果峰面积的 RSD=0.95%，表明仪器精密度良好。

稳定性试验:取同一供试品溶液，于制备后 2，4，8，12，24，32 h时分别进样20μL。结果峰面积值的 RSD=1.86%(n=6)，表明供试品溶液在32 h内稳定。

加样回收试验:精密称取已知含量的样品(含HSYA 70μg/g)6 份，分别精密加入对照品溶液 2，2，4，4，6，6 mL，再分别精密加入 25% 甲醇 23，23，21，21，19，19 mL，按上述方法测定含量，计算加样回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果(n=6)

2.4 样品含量测定

取3批样品，按2.2项下方法制备供试品溶液，并按拟订的色谱条件测定，计算HSYA含量。结果3批样品中HSYA的含量分别为 70.0，94.6，73.7 μg/g。

3 讨论

HSYA是一种小分子黄酮类成分，呈弱酸性，为改善其峰形及分离效果，在流动相中添加了少量磷酸。通过试验发现，选用甲醇-0.5%磷酸溶液(25∶75)，可得到比药典红花项下方法更好的峰形，理论板数更高，故采用本流动相。

曾用甲醇、50%甲醇、25%甲醇作为提取溶剂，进行加热回流和超声处理的比较试验。结果显示，25%甲醇超声处理30 min时提取效率最高，这与HSYA是红花中的主要水溶性组分特征相符[1]。操作中发现，直接过滤比较困难，为解决这一难题，采用了离心后再用微孔滤膜过滤的方法。

[1]侯世斌，李江伟，苏幼红，等.羟基红花黄色素A人工抗原的制备[J].中草药，2008，39(10):1 483-1 486.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:化学工业出版社，2005:103.