刺参粘多糖对人胰腺癌细胞株SW1990增殖的抑制作用

薛魁金 田字彬 孔心涓 王斌 魏良洲 张翠萍 赵清喜

刺参粘多糖对人胰腺癌细胞株SW1990增殖的抑制作用

薛魁金 田字彬 孔心涓 王斌 魏良洲 张翠萍 赵清喜

刺参粘多糖(stichopus japonicus acid muco-polysaccharide，SJAMP)是从中国刺参体壁中提炼出来的一类多糖类物质。该物质成分恒定，结构简单，易于克服空间位阻，增加了对黏膜上皮的穿透能力，容易被吸收。初步研究证实[1-4]，刺参粘多糖具有广谱的抗肿瘤活性，能抑制肝癌、宫颈癌等恶性肿瘤细胞的增殖，诱导细胞分化。本研究观察SJAMP对胰腺癌细胞SW1990增殖、凋亡的影响，探讨其可能机制。

一、材料与方法

1．细胞培养：人胰腺癌细胞株SW1990为青岛大学医学院病原微生物实验室保存，常规培养及传代。 取对数生长期细胞用于实验。

2．四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法：以5×103个细胞(100 μl)接种于96孔板,待细胞生长至75%～80%融合时加入新鲜配置的SJAMP(中国海洋大学海洋药物与生命研究所)，每孔100 μl，终浓度分别为0、2、4、8、16、32 mg/ml，设5个复孔。加药24、48、72 h后，每孔加入5 mg/ml的MTT(Sigma公司)溶液20 μl，继续避光培养4 h，吸去上清液，每孔加入100 μl二甲亚砜，室温避光震荡10 min。在酶联免疫检测仪上测定每孔492 nm波长的吸光值(A492值)。

3．细胞凋亡检测：按照Annexin Ⅴ-PE+7-AAD凋亡检测试剂盒(Millipore Guava technologies公司)说明书操作。将4×105个SW1990细胞(1 ml)接种于6孔板中,24 h后换液，加入新鲜配制的4 mg/ml的SJAMP 1 ml，继续培养24、48、72 h，消化，收集细胞，移入离心管中， 4℃ 1500 r/min离心10 min，用100 μl无血清培养基重悬细胞，加入100 μl Guava Nexin Reagent避光孵育20 min，上Guava EasyCyte Mini 0500-1430流式细胞仪检测细胞凋亡率。

4．细胞周期的检测：按照Guava®Cell Cycle Reagent细胞周期检测试剂盒(Millipore Guava technologies公司)操作。将5×104个细胞(1 ml)的单细胞悬液接种于6孔板中，待细胞生长至75%～80%融合后换无血清RPMI-1640培养液培养48 h，加入终浓度为2、4、8、16、32 mg/ml的SJAMP继续培养24 h。胰酶消化、收集细胞，1000 r/min离心8 min，PBS洗涤1遍后以100 μl PBS重悬细胞，滴入-20℃的70%冰乙醇4℃固定过夜。离心，PBS洗涤后加入200 μl Guava®Cell Cycle Reagent重悬细胞，室温孵育30 min，上流式细胞仪检测细胞周期分布。

二、结果

1．细胞增殖的变化：SJAMP对SW1990细胞的生长具有明显的增殖抑制作用(P<0.05，表1、图1)。

表1 各组SW1990细胞的增殖抑制率

注：与0 mg/ml对照组比较，aP<0.05；bP<0.01

图1 4 mg/ml SJAMP对人胰腺癌细胞SW1990的增殖抑制作用(×100)

2．细胞凋亡率的变化：4 mg/ml SJAMP处理SW1990细胞24、48、72 h的细胞凋亡率分别为(11.10±0.75)%、(21.30±0.91)%、(30.80±0.61)%，随时间延长而逐渐增加，均显著高于未用SJAMP处理同时间点的(3.50±0.34)%、(3.80±0.36)%、(4.40±026)%(P值均<0.01)。

3．细胞周期分布的变化：SJPAM处理后，细胞呈浓度依赖性被阻滞在G0/G1期，与对照组差异具有统计学意义(P<0.05或0.01)；在≥8 mg/ml SJPAM处理后，S期细胞及G2/M期细胞较对照组均显著下降(P<0.01，表2)。

表2 各组细胞的周期分布

注：与0 mg/ml对照组比较，aP<0.05；bP<0.01

讨论刺参属棘皮动物门海参纲刺参科，自古被视为佳肴珍品。刺参酸性粘多糖(SJAMP)是由刺参体壁提取的一种动物酸性粘多糖。研究表明，SJAMP具有广泛的生物活性，如抗凝血、降血脂、抗肿瘤、免疫调节、抗菌、抗病毒等，其中抗肿瘤作用为近年研究的热点。文献报道[5]，SJAMP可明显抑制鼠乳腺肿瘤细胞DNA的合成，使肿瘤细胞生长周期停滞，而对小鼠的正常肝细胞的DNA不仅没有抑制作用，相反可以促进正常肝细胞的有丝分裂。另有研究显示，SJAMP可能通过调控细胞周期来发挥抑制HeLa细胞的增殖[6]。本实验结果显示，SJAMP(>2 mg/ml)呈时间-剂量依赖性抑制SW1990细胞的增殖，增加SW1990细胞的凋亡，并使SW1990细胞阻滞于G0/G1期，推测SJAMP可能通过阻滞人胰腺癌SW1990细胞于G0/G1期而发挥其抑制细胞增殖的效应，其具体机制有待进一步研究。

[1] Saftoleas MC,Moulakakis KG．Pancreatic cancer today．Hepatogastroenterology，2004，51：862-868．

[2] 苏秀榕，娄永江，常亚青，等．海参的营养成分及海参多糖的抗肿瘤活性的研究．营养学报,2003，25：181-182．

[3] 赵秀梅，冯文茹，高巍，等．刺参酸性粘多糖对HepA荷瘤的增效作用及其机制研究．时珍国医国药，2010，21：3062-3063．

[4] 陈玲，于壮，宋扬．刺参粘多糖对人宫颈癌细胞凋亡的影响．奇鲁医学杂志，2009,24:95．

[5] 王振立，刘桂敏，郑瑞，等．刺参粘多糖抑Nd,鼠肿瘤细胞DNA合成及其代谢研究．中国医药工业杂志,1993，24：405-408．

[6] 彭玲，于壮，宋扬.刺参黏多糖对Hela细胞增殖分化的影响.青岛大学医学院学报，2008，44：212.

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.02.021

266003 青岛，青岛大学医学院附属医院消化内科(薛魁金、田字彬、孔心涓、魏良洲、张翠萍、赵清喜)；青岛大学医学院(王斌)

田字彬 Email: tianzb@qdumh.qd.sd.cn

2011-11-21)

(本文编辑：吕芳萍)