5-氮杂-2′-脱氧胞苷对胰腺癌细胞PANC1的组织因子途径抑制物-2表达及CpG岛甲基化的影响

汤志刚 郑浩 黄强 陈炯

·论著·

5-氮杂-2′-脱氧胞苷对胰腺癌细胞PANC1的组织因子途径抑制物-2表达及CpG岛甲基化的影响

汤志刚 郑浩 黄强 陈炯

目的探讨甲基化酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-dC)对胰腺癌细胞系PANC1的抑癌基因组织因子途径抑制物2(tissue factor pathway inhibitor 2，TFPI-2)甲基化水平及基因表达的影响。方法应用1×10-7、5×10-7、1×10-6mol/L的5-Aza-dC处理胰腺癌细胞系PANC1。用甲基化特异性PCR(MSP)、RT-PCR及蛋白质印迹法检测细胞TFPI-2基因的甲基化状态、mRNA及蛋白的表达。结果未经5-Aza-dC处理的PANC1细胞的TFPI-2基因CpG岛为完全甲基化，无TFPI-2 mRNA及蛋白的表达。1×10-7、5×10-7、1×10-6mol/L的5-Aza-dC处理后，PANC1细胞的TFPI-2基因CpG岛甲基化逆转，从不完全甲基化到完全非甲基化； TFPI-2 mRNA相对表达量分别为0.211±0.087、0.327±0.068、0.609±0.017；TFPI-2蛋白相对表达量为0.429±0.121、0.675±0.044、1.132±0.124，呈剂量依赖性增加(P<0.05)。结论胰腺癌细胞系PANC1的TFPI-2启动子高甲基化可能是导致该基因表达下调甚至失活的主要原因。5-Aza-dC能够逆转其高甲基化状态，并诱导TFPI-2 mRNA及蛋白重新表达。

胰腺肿瘤； 甲基化； 组织因子途径抑制物2； 5-氮杂-2′-脱氧胞苷

胰腺癌的发生发展涉及到多个抑癌基因的异常改变，而抑癌基因的失活又涉及多种途径。其中抑癌基因启动子区CpG岛的高甲基化被认为是导致抑癌基因表达沉默甚至失活的主要原因之一[1]。人类组织因子途径抑制物-2(TFPI-2)，又名胎盘蛋白-5，是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂。它能够抑制细胞外基质(ECM)的降解，抑制肿瘤新生血管的生成，诱导肿瘤细胞的凋亡，从而在抑制肿瘤细胞的浸润和转移等一系列生理病理过程中发挥重要的作用[2-3]。本实验应用甲基化酶抑制剂5-Aza-dC干预胰腺癌细胞株PANC1，观察TFPI-2 mRNA、蛋白表达的变化及基因的甲基化状态改变，探讨胰腺癌的发生机制。

材料与方法

一、DNA抽提

胰腺癌PANC1细胞系购自南京凯基生物公司，常规培养、传代。1例正常胰腺组织取自安徽省立医院普外科胆胰病区外伤剖腹探查者，征得患者及家属同意，作为阴性对照。5-Aza-dC购自MERCK公司。取对数生长期细胞，应用1×10-7、5×10-7、1×10-6mol/L的5-Aza-dC处理PANC1细胞4 d，以未经5-Aza-dC处理的PANC1细胞作为对照。采用DNA抽取试剂盒(天根公司)提取细胞及组织DNA。

二、甲基化特异性PCR(MSP)

取1 μg DNA，使用DNA修饰试剂盒(EPIGENTEK公司)进行亚硫酸氢盐修饰。采用Primer Premier5.0软件设计MSP引物，甲基化引物上游5′-TTTCGTATAAAGCGGGTATTC-3′，下游5′-ACGACC-CGCTAAACAAAACG-3′；非甲基化引物上游5′-GGATGTTTGTTTTGTATAAAGTG-3′，下游5′-AAACATCCAAAAAAACACCTAAC-3′。引物由大连宝生物工程有限公司合成。PCR反应条件：95℃ 20 min；94℃ 30 s、52℃ 30 s、72℃ 45 s，40个循环；72℃ 10 min。扩增产物经电泳分离，凝胶成像系统扫描分析。

三、RT-PCR

取上述各组细胞及正常胰腺组织，用Trizol试剂(Gibco BRL公司)提取总RNA，紫外分光光度计检测其浓度和纯度。TFPI-2引物上游5′-CAGAATTCTATGGACCCCGCTCGCCCC-3′，下游5′-CAGTCG-ACTTAAAATTGCTTCTTCCG-3′。以β-actin作为内参照。先逆转录cDNA，再行PCR，反应条件：95℃ 5 min；94℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 30 s，30个循环；72℃ 5 min。扩增产物经电泳分离，凝胶成像系统扫描，以目的基因条带与β-actin条带吸光值比值作为TFPI-2 mRNA的相对表达量。

四、蛋白质印迹法

取上述各组细胞及正常胰腺组织，采用RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂PMSF冰上裂解30 min。4℃离心取上清液，Bradford法行蛋白定量后再行蛋白质印迹法检测TFPI-2蛋白。TFPI-2单抗(Santa Cruz公司)工作浓度1∶500，HRP标记的兔抗鼠IgG工作浓度1∶10000，最后ECL发光。以目的基因条带与β-actin条带吸光值比值作为TFPI-2蛋白的相对表达量。

五、统计学处理

结 果

一、PANC1细胞TFPI-2基因甲基化状态

对照组细胞只有甲基化引物扩增出条带，为完全甲基化；1×10-7、5×10-7mol/L 5-Aza-dC处理的PANC1细胞甲基化及非甲基化引物均扩增出条带，为不完全甲基化；1×10-6mol/L 5-Aza-dC处理的PANC1细胞只有非甲基化引物扩增出条带，为非甲基化(图1)。

M:甲基化产物;U:非甲基化产物

图1空白对照(1)、正常胰腺(2)、PANC1细胞(3)及经1×10-7、5×10-7、1×10-6mol/L 5-Aza-dC处理的PANC1细胞(4～6)的TFPI-2基因甲基化状态

二、各组PANC1细胞TFPI-2 mRNA表达

PANC1细胞不表达TFPI-2 mRNA；1×10-7、5×10-7、1×10-6mol/L 5-Aza-dC处理后的PANC1细胞均表达TFPI-2 mRNA(图2)，相对表达量分别为0.211±0.087、0.327±0.068、0.609±0.017,两两浓度组间的差异均具有统计学意义(P=0.039、0.044)。

三、各组PANC1细胞TFPI-2蛋白表达

PANC1细胞不表达TFPI-2蛋白；1×10-7、5×10-7、1×10-6mol/L 5-Aza-dC处理后的PANC1细胞均表达TFPI-2蛋白(图3)，相对表达量分别为0.429±0.121、0.675±0.044、1.132±0.124，两两浓度组间的差异均具有统计学意义(P=0.006、0.045)。

图2空白对照(1)、正常胰腺(2)、PANC1细胞(3)及经1×10-7、5×10-7、1×10-6mol/L 5-Aza-dC处理的PANC1细胞(4～6)的TFPI-2 mRNA表达

图3空白对照(1)、正常胰腺(2)、PANC1细胞(3)及经1×10-7、5×10-7、1×10-6mol/L 5-Aza-dC处理的PANC1细胞(4～6)的TFPI-2 蛋白表达

讨 论

已经有研究证实，在多种肿瘤中TFPI-2的表达明显减弱，甚至失活[4-9]。而导致该基因失活的主要原因可能是CpG岛启动子区高甲基化的状态。5-Aza-dC作为一种甲基化酶抑制剂，能与DNA甲基化酶共价结合，抑制该酶的甲基化转移活性，逆转肿瘤细胞的基因甲基化，恢复mRNA转录活性和蛋白表达。

本研究结果显示，未经5-Aza-dC 处理的PANC1细胞TFPI-2基因启动子区为完全甲基化状态。经不同浓度5-Aza-dC处理后，细胞的TFPI-2基因的甲基化状态得到了不同程度的逆转，TFPI-2 mRNA及蛋白的表达呈浓度依赖性地重新表达，表明该药物确能逆转基因异常的高甲基化状态，并通过启动子区甲基化程度的降低而恢复其转录活性，发挥其抑制肿瘤的作用。

[1] 刘枫, 李兆中, 许国铭, 等. 特异性PCR法检测胰腺癌p16基因甲基化改变. 胰腺病学, 2002,2,82-84.

[2] Du X, Chand HS, Kisiel W. Human tissue factor pathway inhibitor-2 does not bind or inhibit activated matrix metalloproteinase-1. Biochim Biophys Acta,2003,1621: 242-245.

[3] Baker AH, Edwards DR, Murphy G. Metalloproteinase inhibitors: biological actions and therapeutic opportunities.J Cell Sci,2002,115:3719-3727.

[4] Konduri SD, Srivenugopal KS, Yanamandra N, et al. Promoter methylation and silencing of the tissue factor pathway inhibitor-2(TFPI-2), a gene encoding an inhibitor of matrix metallo-proteinases in human glioma cells.Oncogene,2003,22:4509-4516.

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Effectof5-Aza-dConthemethylationandexpressionofTFPI-2geneinpancreaticcancerPANC1cellline

TANGZhi-gang,ZHENGHao,HUANGQiang,CHENJiong.
DepartmentofGeneralSurgery,AffiliatedProvincialHospital,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230001,China

TANGZhi-gang,Email:tangzg7031@163.com

ObjectivesTo investigate the effects of 5-aza-2-deoxycytidine(5-Aza-dC), a methylation inhibitor, on the expression and methylation of tissue factor pathway Inhibitor (TFPI-2) gene in PANC1 cell line of pancreatic cancer.MethodsPANC1 cell lines were treated with different dosages of 5-Aza-dC (1×10-7, 5×10-7, 1×10-6mol/L). The status of TFPI-2 methylation and expressions of TFPI-2 mRNA and protein were determined by MSP, RT-PCR, and Western blot.ResultsTFPI-2 gene CpG island was completely methylated, and there was no expression of TFPI-2 mRNA and protein without 5-Aza-dC treatment. After treatment with different dosages of 5-Aza-dC(1×10-7, 5×10-7, 1×10-6mol/L), TFPI-2 gene CpG hypermethylation was reversed from incomplete methylated to complete non-methylated. The relative expressions of TFPI-2 mRNA were 0.211±0.087, 0.327±0.068, 0.609±0.017; and the relative expressions of TFPI-2 protein were 0.429±0.121, 0.675±0.044, 1.132±0.124 in a dose-dependent manner (P<0.05).ConclusionsThe hypermethylation of promoter region may be the primary reason for TFPI-2 gene expression down-regulation and inactivation. 5-Aza-dC may reverse the hypermethylation of TFPI-2 gene, and induce the re-expression of TFPI-2 mRNA and protein.

Pancreatic neoplasms; Methylation; Tissue factor pathway inhibitor 2; 5-Aza-dC

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.02.006

国家自然科学基金(81071734)

230001 合肥，安徽医科大学附属省立医院普外科

汤志刚，Email:tangzg7031@163.com

2011-05-27)

(本文编辑：吕芳萍)