胰岛素对人胰腺癌PANC1细胞增殖与侵袭能力的影响

刘涛 王统玲 勾善淼 殷涛 汪理 周伟 李永峰 王春友

·论著·

胰岛素对人胰腺癌PANC1细胞增殖与侵袭能力的影响

刘涛 王统玲 勾善淼 殷涛 汪理 周伟 李永峰 王春友

目的研究胰岛素对人胰腺癌PANC1细胞增殖、侵袭能力及细胞低氧诱导因子(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法采用0.1、1、10、100 nmol/L胰岛素处理PANC1。噻唑蓝法和Transwell小室侵袭实验检测细胞增殖和侵袭能力；蛋白质印迹法和实时PCR法检测增殖性细胞核抗原(PCNA)及HIF-1α、VEGF蛋白和mRNA的表达。结果胰岛素呈剂量依赖性诱导PANC1细胞的增殖，上调HIF-1α、VEGF蛋白表达。100 nmol/L胰岛素干预4 d，PANC1细胞的PCNA蛋白表达显著上调(1.196±0.014比1.157±0.013，P<0.05)；Transwell小室穿膜细胞数量显著增加[(141.0±2.1)个比(89.0±1.4)个，P<0.05]；HIF-1α蛋白表达显著上调(1.139±0.020比0.598±0.013，P<0.05)，但HIF-1α mRNA表达无明显变化；VEGF蛋白表达显著上调(1.011±0.023比0.627±0.013，P>0.05)，VEGF mRNA表达亦显著上调(0.970±0.016比0.350±0.013，P<0.05)。结论高胰岛素微环境可诱导PANC1细胞增殖，并通过上调HIF-1α及VEGF的表达增强细胞的侵袭能力。

胰腺肿瘤； 胰岛素； 增殖； 侵袭； 微环境

胰腺内、外分泌部结构关系紧密，血流经胰岛到达外分泌部，胰岛分泌的胰岛素、胰高血糖素、生长抑素等透过管壁到达腺泡细胞间液营养外分泌细胞[1]。局部组织的胰岛内分泌激素浓度高于体循环[2]，形成了胰腺癌特有的微环境。研究显示，局部高胰岛素微环境可能促进胰腺癌局部生长与浸润[3]。本实验观察胰岛素对人胰腺癌细胞PANC1增殖、侵袭能力及低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。

材料与方法

一、细胞培养

PANC1细胞由协和医院普通外科实验室提供，常规培养、传代。取对数生长期细胞，按每孔1000个细胞接种于96孔培养板，培养液中加入终浓度为0.1、1、10、100 nmol/L的胰岛素(Sigma公司)，以不加胰岛素为对照。每2 d换液。每隔24 h每孔加入噻唑蓝20 μl培养4 h，再加150 μl二甲亚砜溶解的甲瓒，测每孔490 nm处吸光值(A490)。每个浓度设5个复孔，连测7 d。以细胞生长时间为横轴，A490值为纵轴绘制生长曲线。

二、Transwell小室侵袭实验

在Transwell小室(BD公司)上室加入1×105个100 nmol/L胰岛素处理的细胞或对照组细胞。下室加入500 μl含血清的培养液，37℃培养24 h，擦去上室面细胞，HE染色，镜下选择中央及四周5个视野，计膜下室面细胞数。实验重复3次。

三、蛋白质印迹法

取0、0.1、1、10、100 nmol/L胰岛素处理4 h及100 nmol/L胰岛素处理0、2、4、8、12、24 h的PANC1细胞，提取细胞总蛋白，常规行蛋白质印迹法检测增殖性细胞核抗原(PCNA)、HIF-1α、VEGF蛋白的表达，以GAPDH作为内参。兔抗人PCNA一抗购于Thermo公司，兔抗人HIF-1α、VEGF和GAPDH一抗均购于Santa Cruz公司。以目的蛋白与内参条带的灰度比值表示蛋白表达量。

四、实时PCR法

取100 nmol/L胰岛素处理4 h的PANC1细胞，用Trizol提取细胞总RNA。先逆转录成cDNA，然后行实时定量PCR。HIF-1α引物上游5′-TGAAGTGTACCCTAACTAGCCG-3′，下游5′-AATCAGCACCAAGCAGGTCATAG-3′，片段158 bp；VEGF引物上游5′-GAGGGCAGAATCATCACGAAG-3′，下游5′-AGGGAACGCTCCAGGACTTAT-3′，片段402 bp；内参β-actin引物上游5′-AAGGCCAGGTAATTGTCACG-3′，下游5′-AGCAGC TCTGCAGTACGTC-3′，片段105 bp。引物均由上海生工生物技术有限公司合成。PCR反应条件：94℃ 3 min，94℃ 30 s、57℃ 30 s、72℃ 30 s，45个循环。获取各组标本的标准曲线，计算机分析Ct值，待测样品mRNA表达量=2-△△Ct，△△Ct=(△Ct内参-△Ct样品)。

五、统计学分析

结 果

一、胰岛素对PANC1增殖能力的影响

胰岛素呈剂量依赖性诱导细胞的增殖(图1)。100 nmol/L胰岛素干预1、2、4 d后，细胞PCNA蛋白的表达量为0.977±0.009、1.155±0.013、1.196±0.014，较对照组0.891±0.010、1.101±0.012、1.157±0.013的表达量显著上调(P<0.05，图2)。

图1 不同浓度胰岛素对PANC1生长的影响

图2胰岛素干预组(a)和对照组(b)细胞的PCNA蛋白表达

二、胰岛素对PANC1侵袭能力的影响

对照组穿膜细胞数为(89.0±1.4)个，100 nmol/L胰岛素处理组为(141.0±2.1)个(图3)，两组差异具有统计学意义(P<0.05)。

图3胰岛素干预组(a)和对照组(b)的穿膜细胞(HE ×100)

三、PANC1细胞HIF-1α 、VEGF蛋白表达变化

0.1、1、10、100 nmol/L胰岛素处理4 h后，细胞HIF-1α蛋白表达量分别为0.958±0.018、0.996±0.011、1.116±0.011、1.147±0.016，呈剂量依赖性，均较对照组的0.617±0.009显著上调(P值均<0.05)；VEGF蛋白表达量为0.945±0.016、0.981±0.011、1.106±0.012、1.120±0.010，呈剂量依赖性，亦均较对照组的0.789±0.012显著上调(图4a，P值均<0.05)。100 nmol/L胰岛素处理2、4、8、12、24 h后，细胞HIF-1α蛋白表达量分别为0.891±0.018、1.139±0.020、1.101±0.016、0.874±0.014、0.615±0.011，除24 h点外均较对照组的0.598±0.013显著上调(P值均<0.05)；VEGF表达量分别为0.917±0.019、1.011±0.023、1.118±0.020、1.157±0.018、1.162±0.016，均较对照组的0.627±0.013显著上调(图4b，P值均<0.05)。

图4不同浓度胰岛素干预4 h和100 nmol/L胰岛素干预不同时间的PANC1细胞的HIF-1α、VEGF蛋白表达

四、PANC1细胞HIF-1α 、VEGF mRNA表达变化

100 nmol/L胰岛素处理4 h后，细胞HIF-1α mRNA表达量为0.910±0.012，与对照组的0.880±0.011无显著差异；VEGF mRNA表达量为0.970±0.016，较对照组的0.350±0.013显著上调(P<0.05)。

讨 论

流行病学调查显示，2型糖尿病是胰腺癌的独立危险因素，伴2型糖尿病的胰腺癌患者体内胰岛素水平升高，可能影响胰腺癌的恶性生物学行为[4]。此外，胰腺癌细胞表达胰岛素受体[5]，胰腺癌组织中散在分布内分泌细胞[6]。Wang等[7]将鼠胰岛细胞与人胰腺癌细胞共培养，发现培养液中存在高浓度胰岛素，促进癌细胞生长和对葡萄糖的利用。但胰高血糖素与生长抑素无此作用[8]。本实验结果显示，胰岛素以剂量依赖性方式促进胰腺癌细胞增殖，且明显促进癌细胞的侵袭转移能力。

胰腺癌组织HIF-1α高表达，与胰腺癌的恶性生物学行为相关[9]；胰岛素可与低氧协同诱导胰腺癌细胞HIF-1α表达，增加肿瘤细胞对葡萄糖的利用[1]。本实验结果显示，常氧条件下胰岛素明显诱导HIF-1α、VEGF表达上调，但24 h时HIF-1α表达恢复到处理前水平，考虑是胰岛素耗尽后HIF-1α在常氧下被降解所致。然而，胰岛素并不能影响HIF-1α mRNA的表达，却能诱导VEGF mRNA表达，提示胰岛素对HIF-1α的调控处于翻译后水平，对VEGF的调控处于转录水平。

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EffectsofinsulinonproliferationandinvasionofhumanpancreaticcancerPANC1cells

LIUTao,WANGTong-ling,GOUShan-miao,YINTao,WANGLi,ZHOUWei,LIYong-feng,WANGChun-you.
DepartmentofPancreaticSurgery,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,China

WANGChun-you,Email:chunyouwang@mail.hust.edu.cn

ObjectiveTo investigate the effects of insulin on the proliferation and invasion of human pancreatic cancer cells PANC1, and on its HIF-1α, VEGF expression.MethodsPANC1 was pretreated with insulin of different concentrations (0.1, 1, 10, 100 nmol/L). The proliferation of PANC1 was tested by MTT method, and transwell assay was used to test the invasion ability of PANC1. HIF-1α, VEGF and PCNA protein expression was assessed by Western blots, and HIF-1α, VEGF mRNA was detected by real-time PCR.ResultsInsulin could increase the proliferation of PANC1 in a dose-dependent manner (p<0.05), and increase the expression of HIF-1α, VEGF protein. After 100 nmol/L insulin treatment for 4 d, the PCNA protein expression in the insulin group was significantly higher than that in the control group (1.196±0.014vs1.157±0.013,P<0.05). The cancer cells passed through the chamber in insulin group were much more than that in the control group (141.0±2.1vs89.0±1.4,P<0.05). The expression of HIF-1α protein was significantly increased (1.139±0.020vs0.598±0.013,P<0.05), while there was no significant change of HIF-1α mRNA expression. Both the expression of VEGF protein and mRNA were significantly increased (1.011±0.023vs0.627±0.013 0.970±0.016vs0.350±0.013,P<0.05).ConclusionsHigh insulin microenvironment could enhance the proliferation and invasion of PANC1 cells by up-regulating the expression of HIF-1α and VEGF.

Pancreatic neoplasms； Insulin； Proliferation； Invasion； Microenvironment

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.01.007

国家自然科学基金(30801098)

430022 湖北武汉，华中科技大学同济医学院附属协和医院胰腺外科

王春友，Email:chunyouwang@mail.hust.edu.cn

2011-04-07)

(本文编辑：吕芳萍)