P27蛋白及DNA倍体不同表达与结肠癌临床病理学特征的关系

杨志平，杨文颖，盛 望，郭玉琳，李千迅，杨 卓

（1.北京工业大学生命科学与生物工程学院 北 京 北 京100124；2.北华大学附属医院消化科，吉林 吉 林132011；3.吉林省人民医院，吉林 长 春130021）

结肠癌是高发恶性肿瘤，发病率有逐年上升的趋势，且预后较差其主要原因是肿瘤的复发与转移。由于对肿瘤增殖动力学及细胞周期调控认识的深入，希望从细胞分子生物学水平尽早发现癌变，以达早期治疗目的。p27表达蛋白是一种细胞周期的负性调节物，通过影响细胞周期素与cyclin－CDK复合物结合，控制细胞由G1期进入S期的“位点”，从而抑制细胞增殖［1］。目前关于结肠癌DNA倍体类型与临床病理学特征间的关系尚无定论；而不同分期的消化道肿瘤生物学及临床特征亦不相同。我们应用流式细胞术测定结肠癌、直肠癌患者肿瘤细胞的DNA含量，探讨DNA倍体分析对结肠癌临床病理学特征的关系，同时应用免疫组织化学SP法对结肠癌组织中p27表达及与肿瘤临床病理学特征的关系进行了分析。

1 材料与方法

1.1 一般资料

北华大学附属医院及吉林省人民医院（2007年5月－2011年4月）结肠癌手术切除标本130例，患者年龄33－88岁，平均年龄56.5岁；男87例，女43例，男：女≈2：1。TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期66例，Ⅲ、Ⅳ期64例；中、高分化70例，低分化60例，均经病理学诊断。手术前未行任何抗肿瘤治疗。

1.2 实验方法

1.2.1 仪器及试剂 抗p27鼠抗人单克隆抗体、SP试剂盒，DAB显色试剂盒（购自福建迈新生化技术开发公司）；EPICS－XL型流式细胞仪（美国BECKMAN－COULTER公司）；DNA 倍体分析试剂成套产品，PI荧光染料（COULTER公司）。

1.2.2 切片制备 所有标本常规取材，福马林固定，石蜡包埋，4μm厚连续切片，用于免疫组织化学染色。

1.2.3 P27蛋白检测 采用免疫组织化学SP法。以高压枸椽酸盐行抗原修复，DAB显色，胞核、胞浆染为棕色者为阳性细胞。400倍显微镜下每张载玻片计数5个视野，每个视野100个细胞，取阳性细胞数百分比的平均值，＜50%为低表达，≥50%为高表达。

1.2.4 DNA倍体分析 将留取肿瘤标本，放入4℃生理盐水中，部分常规病理检查，部分进行DNA倍体分析。DNA倍体分析方法如下：去除脂肪组织及血块，用眼科剪剪成肉糜状，加入生理盐水，吹散团块呈悬液，180目滤网过滤，再用300目滤膜过滤，800～1 000 r／min离心10 min，去上清，加入PBS混匀，在显微镜下计数细胞，使细胞浓度为（3×105）～（3×106）ml－1，再加适量PI染液5～10 min，上机测定。在直方图上，只有单个G0／G1期单峰的为DNA二倍体，而有2个或者2个以上G0／G1期峰的为DNA异倍体。（DI指数在0.9～1.1为二倍体，其余为异倍体），正常S期细胞比率＜15%。

1.2.5 统计学处理方法 计数资料作χ2检验，P＜0.05，差异有显著性。

2 结果

2.1 P27蛋白在结肠癌及癌旁组织中的表达

结肠癌不同部位组织内P27高表达率不同，癌灶处P27高表达率最低，离癌灶越远，P27表达越高。有显著性差异（P＜0.05）。见表1。

表1 p27在结肠癌及结肠癌旁组织中的表达

2.2 DNA倍体在结肠癌及癌旁组织中的表达

结肠癌组织DNA异倍体与癌旁组织2 cm以内及2 cm－5 cm中的DNA异倍率比较，有显著性差异（P＜0.05）。离癌灶越远，异倍体DNA表达越低。见表2。

表2 DNA倍体在结肠癌及结肠癌旁组织中的表达

2.3 P27蛋白及DNA倍体不同表达与结肠癌临床病理学特征之间的关系

由表3可见，结肠癌组织中p27表达水平与结肠癌的恶性程度、TNM分期相关（P＜0.05），恶性程度越高、TNM分期越晚，p27的表达水平越低。

表3 p27表达与结肠癌临床病理学特征的关系

2.4 DNA异倍体率与肿瘤临床病理学特征之间的关系

由表4可见，通过统计学分析，DNA倍体类型与肿瘤的分化程度、浸润深度、淋巴转移、TNM分期无明显的关系（P＞0.05）。但是我们发现随着浸润深度增加、淋巴结转移、TNM分期增加及分化越差，异倍体比率呈增高趋势。

2.5 结肠癌P27蛋白的表达与DNA倍体的关系

由表5可见，P27的表达的降低会导致DNA的多倍体化，r＝0.468（P＜0.05）。

表4 DNA异倍体率与肿瘤临床病理学特征关系

表5 结肠癌P27蛋白的表达与DNA倍体的关系

3 讨论

p27是国外学者研究较多的一种预后因子，是Polyak等［2］于1994年发现并克隆的参与细胞周期调控的抑癌基因，定位于人染色体12p。其异常表达活性的改变会影响细胞周期进程［3］。进而影响细胞增殖，其与肿瘤发生、发展密切相关。p27蛋白是p27基因的产物，p27蛋白在转录后水平以化学剂量方式与cyclin－CDK复合物结合，阻止细胞增殖，从而使细胞周期停止在G1期。p27蛋白水平低下或缺失，可导致细胞过度增殖，引起肿瘤发生。近年国内外研究发现［3－5］，在多种消化系肿瘤中，P27Kip蛋白的异常表达与肿瘤的进展和不良预后密切相关.本研究结果显示：结肠癌不同部位组织内P27蛋白高表达率不同，癌灶处P27蛋白高表达率最低，离癌灶越远，P27蛋白表达越高。目前，在大肠癌中p27蛋白与肿瘤分化关系的报道不一致。本组资料显示，p27蛋白与肿瘤恶性程度相关，高分化大肠癌中，p27蛋白高表达比例高，低分化大肠癌中，p27蛋白高表达比例低，两组有显著性差异；p27蛋白与TNM分期相关，TNM分期越晚，p27蛋白的表达水平越低。这说明p27影响大肠癌分化途径，促进大肠癌恶性演进，p27的低表达可作为肿瘤恶性程度高的一个指标。我们的结果与Kim等［6］的观点基本一致。

用流式细胞仪能够测定肿瘤细胞的很多参数，分析大量细胞的细胞周期和DNA倍体已经广泛应用于肿瘤基础和临床研究中。人体正常的体细胞均具有较恒定的DNA二倍体含量，细胞癌变过程中常伴随细胞DNA含量的改变，如果DNA含量发生微小的异常变化，就有可能导致恶性肿瘤。DNA非整倍体细胞是恶性肿瘤的特异性标志之一［7］。从流式细胞仪DNA周期分析可进一步判断细胞的DNA倍体水平，DNA含量分析对结直肠癌患者的预后判断已有相关报道，虽然其预后价值尚不能肯定，但多数研究者认为DNA二倍体肿瘤患者较异倍体患者有较好的生存期［8，9］。也有学者认为DNA倍体与大肠癌Dukes.分期无关［10］，与淋巴转移无关［11］，与组织学类型无关［12］。本研究结果表明：DNA倍体类型与肿瘤的分化程度、浸润深度、淋巴转移、TNM分期无明显的关系；但是发现随着浸润深度增加、淋巴结转移、TNM分期增加及分化越差，异倍体比率呈增高趋势。因此，测定细胞核DNA含量与倍体分析可以了解细胞增殖状态，从而判断细胞有无恶变倾向或恶性程度，其对恶性肿瘤的早期诊断具有重要价值。同时，P27蛋白表达的降低会导致DNA的多倍体化，两者呈负相关关系。

综上，本研究认为，p27蛋白低表达是促进大肠癌恶性演进的因素；P27蛋白的免疫组化检测结合DNA倍体分析有助于反映结肠癌发生、发展、生物学行为和预后，两者可以作为结肠癌临床分期和预后的监测指标之一。

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