大肠癌原发灶及粪便标本中基因mRNA表达及其临床意义

赵金伟，李 韬，马 震，董 强，王钟林＊

（1.吉林省人民医院 急 诊外科；2.吉林大学白求恩医学院09级，吉林 长 春130021）

几项有关粪便基因mRNA检测技术在结直肠癌诊断中的研究报告表明，采用RT－PCR技术检测结直肠癌病人粪便基因的异常表达对结直肠癌诊断率较高，但关于CD44、COX－2、CK－20m RNA在病灶及粪便中表达是否具有同源性，能否作为CRC的诊断标记物有待于研究。

本实验的目的是通过对COX－2，CK－20，CD44v6m RNA在结直肠原发灶及病人粪便中的表达，证实粪便中COX－2，CK－20，CD44v6mRNA表达来源于原发灶肿瘤细胞的脱落所致，为临床结直肠癌筛查选择合适的多基因标记物联合检测指标。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床资料 收集吉林省人民医院及吉林省肿瘤医院2008年1月－2010年2月行结直肠癌根治术的结直肠癌原发灶38例，所有患者术前均未行抗肿瘤治疗，其中，男性20例，女性18例，年龄42－81岁，平均年龄62岁，Duke＇s A、B期13例，Duke＇s C、D期25例。分化程度：高中分化15例，未、低分化23例。患者术前2－3天在医生指导下用带盖粪便标本盒收集粪便标本，在2小时内送于实验室，分装后－80℃保存，对术中切除的病变标本切取一部分置于标本盒内，置于－80℃冰箱中保存备用。粪便标本均为服药前或灌肠前留取标本。

1.1.2 粪便标本的预处理 粪便标本解冻后，取成形粪便标本3－5克或水样便100毫升加入100毫升液基细胞保存液100毫升搅拌均匀后，依次经过100目筛网，200目筛网，1200转／分（rpm）离心10min后弃去上清液，加提取液重悬沉淀至50毫升，过300目筛网，1200转／分（rpm）离心10min后弃去上清液，取沉淀加入液基细胞保存液1.5毫升置于1.5ml Eppendorf管中，上述标本处理1小时完成，并置于－80℃冰箱中保存。

1.2 PT－PCR法检测结直肠癌原发灶及粪便标本中基因mRNA表达

1.2.1 总RNA的提取 用DEPC严格处理实验器材以防止RNA酶污染。解冻组织标本或粪便预处理后的标本，研磨后加入PBS洗涤，1000 rpm，5分钟，弃上清 →加1ml Trizol，室温放置5分钟，转到EP管加0.2 ml氯仿重悬沉淀，剧烈振摇，室温静置5 min→4℃12000 rpm，离心15 min→上层水相移至另一EP管（宁少勿多）→加入0.5 ml冰异丙醇→充分混匀，室温放置10 min→4℃12 000 rpm，离心15 min，去上清→加入75%冰乙醇－DEPC1 ml，振摇洗涤沉淀→4℃12000 rpm，离心10 min，弃上清→去乙醇，空气中干燥RNA→加DEPC水（10－50μl），溶解RNA→所得的总RNA置于－80℃冰箱保存。

1.2.2 RNA纯度及完整性检测 取RNA样品用紫外－可见光分光光度计于260 nm、280 nm处测定A值，计算RNA浓度和RNA定量。取RNA样品进行甲醛变性，1%琼脂糖凝胶电泳，拍照，用光密度扫描仪扫描28s和18s条带，计算密度比值。

1.2.3 引物设计［1－3］实验所需引物及内参照βactin引物均系上海生工生物工程公司合成，经Genebank检索为特异性引物。DNA Marker采用宝生物工程有限公司DL2000 Marker。

1.2.4 RT－PCR技术检测COX－2，CK－20，CD44v6 m RNA表达

①逆转录

RNA 4μl＋Oligod T 2μl＋DEPC 10μl—72℃，5分钟，变性模板RNA—迅速放置冰上，复性模板RNA—5×buffer 5μl＋10 m Md NTP 2μl＋25u／μl Rnasin 1μl＋200 u／μl mmlv 1μl—42℃，1 h—94℃，5 min—冰上，5 min，置－80℃储存。

②聚合酶链式反应

反应体系：灭菌去离子水32μl；10×PCR buffer 5μl；10 mmol／Ld NTP 1μl；10pmol上游引物1 μl；10pmol下游引物1μl；cDNA（0.1 ug／μl）1μl。

③Taq DNA 聚合酶（2u／μl）0.2μl增条件

β－actin：取cDNA 2μl，加入10×Bufer 2μl，25 mmol／L氯化镁溶液 1.2μl，Taq 酶 1 U，22.5 mmol／L d NTPs 0.16μl，β－actin引物0.1μg，加去离子水至20μl进行PCP扩增。每次设一管不加样品cDNA为阴性对照。反应条件为94℃预变性5 min，94℃变性30s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30循环，72℃延长7 min。基因扩增产物经2%琼脂糖凝胶（含0.1%溴化乙啶）电泳，拍照。

目的基因：逆转录产物2μl，加入10×PCR Bufer 3μl，目的基因引物20 pmol，β－actin引物4 pmol，Taq DNA酶1 U，DEPC处理过的水至30μl。反应条件为95℃预变性2 min，95℃变性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，共45循环。基因扩增产物经2%琼脂糖凝胶（含0.1%溴化乙啶）电泳，拍照。

1.2.5 结果判定 图片中出现305 bp、370 bp、125 bp的条带分别为COX－2、CK－20及 CD44v6 mRNA表达阳性。

1.3 统计学处理

采用χ2检验，应用统计软件SPSS10.0处理，P＜0.05为具有显著性差异。

2 结果

2.1 COX－2mRNA在结直肠癌原发灶及粪便标本中的表达

COX－2mRNA在癌原发灶及粪便标本中均可表达，在癌原发灶组织中COX－2m RNA表达的阳性率为57.9%（22／38）；COX－2mRNA 在癌患者粪便中表达的阳性率为47.4%（18／38）；COX－2mRNA在癌原发灶及粪便中同时阳性表达率为44.7%（17／38），同时阴性表达率为39.5%（15／38），同源性为84.2%（32／38）；同源性与异源性相比，差异具有显著性，p＝1.5×10－5。如表1所示。

表1 COX－2mRNA在结肠癌原发灶及粪便标本中的表达

2.2 CK－20mRNA在结直肠癌原发灶及粪便标本中的表达 CK－20mRNA在结直肠癌原发灶及粪便标本中均可阳性表达，在结直肠癌原发灶组织中CK－20mRNA表达的阳性率为52.6%（20／38）；CK－20m RNA在粪便标本中的阳性表达率为55.3%（21／38）；CK－20mRNA在结直肠癌原发灶及粪便中同时阳性表达率为44.7（17／38）；36.8%（14／38）同时无表达，同源性为81.5%（31／38），同源性与异源性相比，差异具有显著性，P＝0.0001。如表2所示。

表2 CK－20mRNA在结直肠癌原发灶及粪便标本中的同源性表达

2.3 CD44v6mRNA在结直肠癌原发灶及粪便标本中的表达 CD44v6m RNA在结直肠癌原发灶及粪便标本中均有较高的阳性表达，在结直肠癌原发灶组织中CD44v6m RNA表达的阳性率为55.3%（21／38）；CD44v6mRNA在粪便标本中的表达阳性率为50.0%（19／38）；CD44v6mRNA 在结直肠癌原发灶及粪便标本中同时阳性表达率为50（19／38）；44.7%（17／38）同时无表达，同源性为94.7%（36／38），同源性与异源性相比，差异具有显著性，P＝1.8×10－8。如表3。

表3 CD44v6mRNA在结直肠癌原发灶及粪便标本中的同源性表达

3 讨论

结直肠癌（CRC）是消化道常见的恶性肿瘤，对CRC的研究表明，CRC的癌变机制和筛选方法是目前消化道肿瘤中最为明确和完善的，在易感人群中进行筛查是CRC的主要防治策略之一，业已证实，CRC筛查可以明显减少CRC的发生，并且，早期诊断及治疗可明显提高患者的生存率。对于结直肠癌病人的筛查，未来的热点是在非肠道准备下易被患者接受的检查［4］。粪便基因检测法是检测患者粪便基因的改变，无侵袭性、无需特殊准备、且可检查整个大肠病变，是目前无创性筛查大肠肿瘤病变的研究热点。

目前，粪便基因mRNA标记物的研究刚刚起步，日本学者对粪便COX－2mRNA检测分析发现，COX－2m RNA表达对结肠癌诊断的敏感性和特异性分别为90%，100%。但 Wai K等［1］研究显示，COX－2m RNA表达在结直肠癌中的阳性率仅为50%，腺瘤仅为4%，因此，粪便基因mRNA表达大肠癌诊断有待于进一步研究，联合检测粪便多个基因m RNA表达是否能够用于大肠癌的筛查也有待于进一步研究。目前尚未见有关文献报道结直肠癌患者粪便相关基因m RNA表达与结直肠癌原发灶肿瘤的相关性，二部位基因mRNA表达是否具有同源性等有待于进一步证实，本实验采RT－PCR技术对38例结直肠癌患者的原发灶及粪便标本中的COX－2，CK－20及 CD44v6mRNA 表达进行检测，结果发现，COX－2，CK－20及 CD44V6m RNA 均可表达于肿瘤原发灶及患者粪便标本中，COX－2mRNA在结直肠癌原发灶及粪便标本中同时阳性表达率为44.7%（17／38），同时阴性表达率为 39.5%（15／38），同源性表达率为84.2%（32／38），与异源性表达相比，差异具有显著性，P＝1.5×10－5，结果提示，结直肠癌粪便患者标本COX－2m RNA表达与结直肠癌原发灶COX－2mRNA表达密切相关，粪便标本COX－2m RNA表达主要来源于结直肠癌原发灶脱落细胞的COX－2mRNA，因此，检测粪便标本COX－2m RNA表达可以替代原发灶COX－2mRNA表达，作为结直肠癌的一种无创性的粪便基因标记物。Yamauchi等［5］的研究发现，COX－2在正常大肠上皮细胞中几乎完全不表达，在腺瘤中表达有所增加，而在大肠癌组织中高表达，提示COX－2的高表达可能参与了大肠癌的发生。因粪便标本COX－2m RNA在结直肠癌中的阳性率仅为47.4%（18／38），为提高粪便标本基因m RNA表达检测诊断结直肠癌的检出率，本实验对粪便标本 CK－20，CD44v6m RNA表达进行了同样的研究，CK－20m RNA在结直肠癌原发灶及粪便标本中均可阳性表达，在原发灶中的阳性率为52.6%（20／38），在粪便 标 本 中 的 表 达 率 为 55.3% （21／38），CK－20m RNA在结直肠癌原发灶及粪便标本中同时阳性表达率为44.7%（17／38），36.8%（14／38）同时无表达，同源性为81.5%（31／38），同源表达率与异源性相比，差异具有显著性，P＝0.0001。结果提示，结直肠癌患者粪便标本CK－20m RNA表达与结直肠癌原发灶CK－20mRNA表达密切相关，粪便标本CK－20m RNA表达来源于结直肠癌脱落细胞的CK－20m RNA表达，因此，检测粪便标本CK－20mRNA表达可以替代原发灶CK－20mRNA表达，作为结直肠癌的无创性基因标记物。既往研究表明，CK－20不同于其它的角蛋白，非常局限于胃肠上皮细胞，几乎所有的结直肠癌均明显表达，且在侵袭，转移，扩散到其它组织时始终保持稳定。但Stefan Wildi等［6］的研究认为，对41例结直肠癌采用Northern杂交技术，免疫组化及原位杂交技术检测CK－20表达，发现病灶CK－20表达不及正常对照组强，为此，本实验采用RT－PCR技术检测结直肠癌原发灶及癌旁正常粘膜组织的CK－20mRNA表达，发现癌灶CK－20mRNA表达呈强阳性，而正常粘膜组织呈弱阳性或阴性，与Stefan Wildi的实验结果不符，有待于进一步实验研究。采用 RT－PCR技术对CD44v6m RNA表达进行检测分析，发现CD44v6mRNA在结直肠癌原发灶及粪便标本中均有较高的阳性表达，CD44v6 m RNA在结直肠癌原发灶中的阳性表达率为55.3%（21／38），在粪便标本中的阳性表达率为50%（19／38），在原发灶及粪便标本中同时阳性表达率为50%（19／38），44.7%（17／38）同时无表达，同源性为94.7%（36／38），同源性与异源性相比，差异具有显著性，P＝1.8×10－8，结果提示，结直肠癌患者粪便标本CD44v6mRNA表达与结直肠癌原发灶CD44v6m RNA表达密切相关，粪便标本CD44v6mRNA表达来源于原发灶脱落细胞的CD44v6m RNA。Wong等［7］报道，结直肠癌组织及转移组织内都有CD44变异的过度表达，而在正常的结直肠细胞内未见CD44v6表达［8］。Yamao等［9］采用RT－PCR和Southern blot技术检测粪便脱落细胞，在所有正常及结直肠癌病例中均检测到CD44s，而CD44v6和CD44v10在结肠癌术前阳性率分别为68%和60%，术后阳性率明显下降，分别为12%和28%，CD44v6分子的表达在术后转阴率为88.2%，CD44v10的转阴率为 80%，并且CD44v6和CD44v10均可在Dukes A期患者术前粪便中检出。Tatin［10］采用同样的手段检测体液，瘘液，粪便及尿液中CD44基因时，发现它们具有同样的敏感性。

本研究表明，CD44、COX－2、CK－20m RNA 在结直肠癌病人原发灶及粪便中表达具有较高的同源性，通 过 检 测 粪 便 标 本 中 CD44、COX－2、CK－20m RNA表达替代检测原发灶中CD44、COX－2、CK－20m RNA表达用于肿瘤的诊断、预后等，但能否作为CRC的诊断标记物有待于研究。

［1］Wai K，Leung，Ka Fai To，Ellen PS，et al.Detection of hypermethylated DNA or cyclooxygenase－2 messenger RNA in fecal samples of patients with colorectal cancer or polyps［J］.Am J Gastroenteral，2007，102：1070.

［2］卢培琳，季 峰，彭克荣，等.胃癌患者CD44mRNA 的表达［J］.浙江医学，2004，26（3）：184.

［3］Stephen A，Bustin，Shabab S，et al.Quantification of cytokeratin 20，carcinoembryonic antigen and guanylyl cyclase C mRNA levels in lymph nodes may not predict rreatment failure in colorectal cancer patients［J］.Int J Cancer，2004，108：412.

［4］Pickhardt PJ，Choi JR，Hwang I，et al.Computed tumorgraphic colongrapy to screen for colorectal neoplasia in asymptomatic adults［J］.N Engl J Med，2003，349：2191.

［5］Yamauchi T，Wayanake M，Rubtoa T，et al.Cyclooxygenase－2 expre ssion as a new marker for patients with colorectal cancer［J］.Dis Colon Rectum，2002，45：98.

［6］Stefan Wildi，Jorg KL，Haruhisa MA，et al.Charcterization of cytokeratin 20 expression in pancreatic and colorectal cancer［J］.Cancer Res，1999，5：2840.

［7］Wong CSC，Cheung MT，Ma BBY，et al.Isolated tumor cells and circulating CK20 mRNA in p No colorectal cancer patients［J］.Int J Surg Pathol，2008，16（2）：119.

［8］Ishida T.Immunohistochemical expression of the CD44 variant 6 in colorectal adeno－carcinoma［J］.Surg Today，2000，30（1）：28.

［9］Yamao T，Matsumura Y，Shimada Y，et al.Abnormal expression of CD 44 variants in the exfoliated cells in the feces of patients with colorectal caner［J］.Gastroenterology，1998，114（6）：1196.

［10］Tarin D，Matsumura Y.Deranged activity of the CD44 gene and other loci as biomarkers for progression to metastatic malignancy［J］.J Cell Biochem Suppl，1993，17（1）：173.