人原发性肺癌组织中TSLC1基因甲基化检测及意义

亢春彦，陈 洁，肖 红，汤少鹏，薛玉仙，张秀芝，吕丰收

（1.河南职工医学院病理学教研室，河南 郑 州451191；2.河南省胸科医院胸外科，河南 郑 州450003）

TSLC1（tumor suppressor in lung cancer 1）基因，是正常人体组织广泛表达的免疫球蛋白样细胞黏附分子［1］。已证实TSLC1启动子区甲基化在多种肿瘤中是一个频发事件，与TSLC1的表达下调呈相关性［2－4］。

本研究采用甲基化特异性的聚合酶链技术（Methylation specific PCR，MSP），检测了人原发性肺癌组织、肺良性病变组织、癌旁组织及支气管鳞状化生组织中TSLC1基因启动子区CpG岛甲基化状况，观察TSLC1基因在不同肺组织中的甲基化状态，探讨其与肺癌发生发展之间的关系。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集 收集53例肺癌手术切除标本，24例肺良性病变组织，15例癌旁组织和11例支气管鳞状化生镜检组织。标本取自河南省胸科医院。入组条件：（1）患者均经过病理确诊（2）患者未经任何放、化疗（3）无其他肿瘤病史。肺癌组：鳞癌31例、腺癌16例、小细胞癌6例。肺良性病变组：肺结核9例，肺炎8例，炎性假瘤4例，肺脓肿2例，间质性肺病1例。标本于术后或镜检后半小时内获得，－70℃冰箱保存。

1.2 DNA的提取 采用DNA纯化试剂盒（上海生物工程有限公司）提取组织基因组DNA，操作步骤按说明书进行。

1.3 DNA的修饰 采用DNA修饰试剂盒（Chemicon公司）亚硫酸氢盐修饰基因组DNA，修饰后的DNA通过乙醇沉淀回收并重悬于去离子水中，用于甲基化特异性PCR。

1.4 寡核苷酸引物 设计合成2种引物：甲基化特异的引物（TSLC1－M），上游引物5’＇－TTTTAATTATTTTCGAGTTTATCG；下游引物5’－TCTT－TAAAAACGAAAACTATACG。非甲基化特异的引物 （TSLC1－U），上 游 引 物 5’－TTTTTAATTATTTTTGAGTTTATTG；下 游 引 物 5’－AATCTTTAAAAACAAAAACTATAC。2种引物扩增片断长度均为109 bp。

1.5 PCR扩增反应及检测方法 PCR反应体系总体积为50μl：10×PCR缓冲液2.5μl，10 mmol／L 4×d NTP 4μl，25 mmol MgCl24μl，上下游引物各1μl，已修饰的DNA模板10μl，Taq酶2U。反应条件为：94℃预变性5 min；94℃1 min，特定退火温度（TSLC1－M：60℃；TSLC1－U：57℃）1 min，72℃1 min，共35个循环；72℃延伸10 min。为保证检测的可靠性，以经甲基化转移酶（SssI Methylase）处理的和未经SssI酶处理的正常人外周血淋巴细胞DNA分别作阳性和阴性对照。不含DNA的蒸馏水作为空白对照。PCR产物2%琼脂糖电泳分离，紫外检测仪下观察并拍照。

1.6 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件，对各组间的比较采用χ2检验，用精确概率法确定概率。

2 结果

2.1 TSLC1基因目的片断的MSP扩增结果（图1，图2）

图1 T－M引物PCR扩增结果

M 为 Marker（DL2，000）；1，2为肺癌标本；3，4为癌旁组织；5，6为肺良性病变组织；7为支气管鳞状化生组织；8，9分别是阳性和阴性对照；10为空白对照

2.2 MSP结果分析

2.2.1 TSLC1基因甲基化在各组中发生率的比较提取肺癌组，癌旁组和良性病变组中的基因组DNA，进行甲基化检测，甲基化率分别为35.8%（19／53）、13.3%（2／15）、0%（0／24），三组比较差异有统计学意义（P＜0.05），进一步做两两比较，肺癌组与良性病变组有显著性差异（P＜0.01）；癌旁组与良性病变组差异也具有统计学意义（P＜0.05）。支气管鳞状化生组织的甲基化阳性率为18.2%，高于良性病变组（0%），但两者相比差异不具有统计学意义（P＞0.05）。

2.2.2 TSLC1基因甲基化与肺癌病理类型的相关性 对全部53例肺癌组织DNA进行MSP扩增，结果显示31例鳞癌、16例腺癌和6例小细胞癌中TSLC1基因甲基化阳性率分别为38.7%（12／31）、37.5%（6／16）、16.7%（1／6），经统计学检验，三者间差异无统计学意义（P＞0.05），即TSLC1基因甲基化发生率与病理类型无相关性（表1）。

2.2.3 TSLC1基因与肺癌临床病理特征的相关性（表1）

表1 TSLC1甲基化状态与肺癌临床病理资料的关系

2.2.4 肺癌吸烟者与非吸烟者TSLC1基因甲基化比较 53例肺癌患者按吸烟指数（每天吸烟支数×吸烟年数）的不同分为吸烟组（≥400支）和非吸烟组（≥400支），分别进行TSLC1基因甲基化的检测，40例吸烟者中16例发生TSLC1基因甲基化，阳性率为40.0%，13例非吸烟者TSLC1基因甲基化阳性率为23.1%（3／13），差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

基因启动子区甲基化改变不仅直接或间接影响基因转录，也可通过5－甲基胞嘧啶脱氨基诱发胞嘧啶转变为胸腺嘧啶，诱发基因表达异常，还可引起染色体结构改变，导致基因表达不稳定从而产生肿瘤［5］。Heller等［6］研究了 TSLC1在肺癌细胞株中的表达和甲基化形式。结果显示：44%的NSCLC细胞株及9%的小细胞肺癌细胞株中发现TSLC1表达缺失；33%的NSCLC细胞株、9%的SCLC细胞株中存在TSLC1甲基化。但是，关于TSLC1基因甲基化与人原发性肺癌组织的关系的研究却还不够深入。

MSP法特异性高，敏感性高，有少许肿瘤细胞发生甲基化即可被检测出。本研究结果表明肺癌组织中TSLC1基因启动子高甲基化发生率为35.8%，15例癌旁组织有2例出现了甲基化阳性片断，肺良性病变组织没有1例发生甲基化。提示TSLC1基因启动子甲基化与肺癌的发生关系密切，对肿瘤的生长、局部浸润可能起一定的促进作用。支气管鳞状化生组织甲基化检出率为18.2%（2／11），进一步提示，TSLC1基因甲基化在肺癌的发展过程中可能是一个早期事件，是多步骤肺癌发生过程的始动因素。TSLC1基因甲基化在肺癌不同组织分型、病理分级、临床分期，是否淋巴结转移间均无显著性差异，说明TSLC1基因甲基化可能与肺癌组织分型、病理分级、临床分期及肿瘤的转移和预后无关。

研究证实，吸烟是肺癌发生的危险因素，香烟中含有BPDE等致癌物。BPDE－DNA加合物在甲基化的Cp G与非甲基化Cp G位点的分布区别很大，Cp G中5－MC是容易形成加合物的位点，因而与DNA中其它碱基相比，甲基化的Cp G可能更容易受到BPDE等化学致癌物的攻击［7］。本实验对肺癌吸烟者（40例）和非吸烟者（13例）分别进行TSLC1基因甲基化的检测，结果显示，吸烟的肺癌患者TSLC1基因甲基化率为40.0%（16／40），明显高于非吸烟肺癌患者（23.1%，3／13），但两组间差异无统计学意义。该结果提示，吸烟可能不是TSLC1的启动子发生甲基化的主要机制，结合本实验考虑也可能与实验标本过少，难以全面确切证明TSLC1基因甲基化与吸烟的关系，但不可否认的是有一部分吸烟患者确实发生了TSLC1启动子区的甲基化，因此甲基化与吸烟的关系需作进一步的探讨。

综上所述，TSLC1基因甲基化与肺癌的发生关系密切，可能是肺癌早期的重要标志物之一。因此对TSLC1基因甲基化进一步研究可能对探讨肺癌的发生发展机制，以及肺癌的早期预警有重要意义。

［1］Heller G，Geradts J，Zieqler B，et al.Downregulation of TSLC1 and DAL－1 expression occurs frequently in breast cancer［J］.Breast Cancer Res Treat，2007，103（3）：283.

［2］Tsujiuchi T，Sugata E，Masaoka T，et al.Expression and DNA methylation patterns of Tslc1 and Dal－1 genes in hepatocellular carcinomas induced by N－nitrosodiethylamine in rats［J］.Cancer Sci，2007，98（7）：943.

［3］Chen K，Wang G，Peng L，et al.CADM1／TSLC1 inactivation by promoter hypermethylation is a frequent event in colorectal carcinogenesis and correlates with late stages of the disease［J］.Int J cancer，2011，128（2）：266.

［4］Overmeer RM，Henken FE，Snijders PJ，et al.Association between dense CADM1 promoter methylation and reduced protein expression in high－grade CIN and cervical SCC［J］.J Pathol，2008，215（4）：388.

［5］Toyooka S，Mitsudomi T，Soh J，et al.Molecular oncology of lung cancer［J］.Gen Thorac Cardiovasc Surg，2011，59（8）：527.

［6］Heller G，Fong K M，Girard L，et al.Expression and methylation pattern of TSLC1 cascade genes in lung Carcinomas［J］.Oncogene，2006，25（6）：959.

［7］Breitling LP，Yang R，Korn B，et al.Tobacco－smoking－related differential DNA methylation：27K discovery and replication［J］.Am J Hum Genet，2011，88（4）：450.