基因芯片技术及其在结核分枝杆菌检测中的应用

荣爱红，赵蓬波，侯晓杰

（吉林省人民医院，吉林 长春130021）

结核病是由结核分枝杆菌引起的一种慢性传染病，主要侵犯肺脏。在某些经济欠发达地区，许多结核病患者因为得不到全程，合理的救治而产生结核耐药，这使得控制结核病的发生发展成为世界性问题。目前，临床实验室采用的检测结核分枝杆菌的方法主要有抗酸染色法和细菌培养法。抗酸染色法简便、实用、快捷，但非结核性分枝杆菌亦可出现阳性结果；细菌培养作为结核病诊断的金标准，虽优于抗酸染色法，但时间比较长，影响早期用药；荧光染色和PCR是可供选择的检测方法，却可能出现假阳性和假阴性；而依赖于基因芯片的PCR杂交法敏感性和特异性均高，是比较准确的检测方法［1］。

1 基因芯片

基因芯片（gene chip）技术是随着“人类基因组计划”（human genome project，HGP）的进展而发展起来的，它是21世纪以来影响最深远的重大科技进展之一，是物理学、微电子学与分子生物学综合交叉形成的高新技术。

1.1 基因芯片的概念

基因是指具有遗传效应的DNA片段，位于细胞的染色体上。我们将大量的基因片段按一定的顺序固定在特定的载体上，即为基因芯片。在一块约1cm2大小的芯片上，可固定数千甚至上万的基因片段，由此形成一个密集的基因方阵，方便对多个基因进行同步检测［2］。

1.2 基因芯片的优点

基因芯片作为一种先进的、大规模、高通量的检测技术，正逐步成为疾病诊断的尖端技术之一［3］，其优点主要表现在：一，灵敏性和准确性；二，快捷简便性；三，同步性。在医学领域，医生针对多种相似病原菌进行鉴别诊断时，若能应用基因芯片技术，则短时间内就能知道病人是哪种微生物感染，这对指导临床合理，及时，准确的用药提供了很大的方便。

1.3 基因芯片的分类［4］

基因芯片有多种分类方法：

1.3.1 按基因芯片所用载体材料分：玻璃芯片，硅芯片，陶瓷芯片；其中，玻璃芯片较常见。

1.3.2 按芯片点样方式的不同分：原位合成芯片，微距阵芯片，电定位芯片。

1.3.3 按基因芯片用途分为：表达谱芯片，诊断芯片，指纹图谱芯片，测序芯片等。

1.4 基因芯片的用途

基因芯片技术的准确灵敏性，同步性，所需样本少，污染少的特点，使其不仅在疾病检测方面有广泛应用，在法医学鉴定，药物筛选方面及环境科学方面同样有重要的使用价值。

1.4.1 疾病检测诊断方面，基因芯片只需少量标本，在短时间内，即可对所需鉴别的疾病进行同步化检测，不仅能帮助医生尽早做出诊断，还能减轻病人的痛苦，一举两得。

1.4.2 法医学方面，基因芯片优于早先的DNA指纹鉴定［5］，将这些具有遗传效应的基因片段分析处理后，可以更准确的推断生命体的特征，常被应用于尸体鉴定及亲子鉴定。

1.4.3 药物筛选方面［6］，基因芯片通过分析用药前后机体基因表达谱的改变，来判断药物的疗效，省时省力又准确。

1.4.4 环境科学方面，目前，基因芯片已经应用于［7］土壤中微生物的检测，水中病原菌及毒物鉴定，如果应用恰当的话，可以解决人类日常生活中不少问题，使人们的生活水平得到提高。

1.5 基因芯片的原理

基因芯片是将已知核酸序列的DNA，固定在某种载体上，然后与待测样品中的DNA或RNA，按照碱基互补配对原则进行杂交，再经过特定计算机软件的处理，获得待测样品的信息。如果待测样本为RNA，一般先经逆转录过程，形成RNA－DNA杂交体，经RNA酶的水解，变为单链DNA，再与已知的探针进行杂交［8］。

1.6 基因芯片技术的主要技术环节

基因芯片主要包括4个基本技术环节［9，10］：1.芯片制备；2.样品制备；3.分子之间相互反应；4.反应结果的检测及分析。

1.6.1 芯片制备 目前，芯片的制备主要采用的载体有玻璃片或硅胶片，再将DNA、RNA片段或蛋白质分子按一定顺序排列在载体上，形成芯片。

1.6.2 样品制备 样品的制备和处理是该技术的第2个重要环节。我们所接触的样品都是复杂的生物分子混合体，一般不能直接与基因芯片进行反应。因此，需要将这些混合体进行特定的生物处理，以获取所需的DNA、RNA片段或蛋白质分子等，并加以标记，以提高检测的灵敏度。

1.6.3 分子之间相互反应 此反应是芯片检测的关键一步。为了使反应更加精确，通常需要人为地调节反应所需的最适环境，以减少错配率，从而获取最能反映生物本质的信号。

1.6.4 反应结果的检测及分析 目前，芯片信号检测方法是应用芯片扫描仪，通过采集各反应点的荧光强弱和荧光位置，经过软件分析，即可以获得相关的生物信息。

1.7 基因芯片的国内外研究现状［11］

鉴于基因芯片的诸多优点，世界上的许多国家和地区都已着手进行基因芯片的研制和开发，美国政府于1998年正式启动基因芯片计划，国立卫生研究院（NIH）、能源部、中央情报局等均参与了此项目。同时斯坦福大学、麻省理工学院及部分国立实验室如Argonne，Oakridge也参与了该项目的研究和开发。英国剑桥大学、欧亚公司也正在从事该领域的研究。世界大型制药公司对基因芯片技术用于基因多态性、疾病相关性、基因药物开发和合成或天然药物筛选等领域感兴趣，也已建立或正在建立自己的芯片设备和技术设备。

我国人口众多，有着丰富的基因资源，由于所有疾病和遗传信息都与基因有着密切的联系，因此基因研究具有特别重要的价值，基因芯片技术的发展将大大促进我国的人类基因组计划的进程。目前国内掀起基因芯片的研究热潮，联合基因科技集团有限公司成功地制作了国内第一块基因表达谱芯片和HCV诊断芯片，并通过了由上海市科委组织的专家鉴定，标志着我国的芯片研究已跟上国际同行发展的步伐，走向产业化进程。

2 基因芯片在结核分枝杆菌中的应用

2.1 基因芯片对结核分枝杆菌耐药性的研究

基因芯片对结核分枝杆菌的研究一经报道，立即引起了国内外学者的高度重视，成为［12，13］本世纪分子生物学的研究热点。在结核分枝杆菌耐药性检测方面，芯片技术可将所有突变的探针固定到一张芯片上，只须一次杂交，即可获得某一菌株对所有药物的敏感性结果，因而对指导医生合理用药非常有价值，并为控制疾病的传播提供了可能性［14］。

2.1.1 1998年，Gingeras等［12］利用结核分枝杆菌rpoB基因保守区705bp特异核苷酸序列探针与基因芯片杂交，对10种121株分枝杆菌进行基因分型与菌种鉴定。作者用rpoB寡核苷酸芯片技术与常规双脱氧核苷酸测序方法，分析了10种分支杆菌种间与种内的序列多样性，并确证了几种特异性单碱基多态性。

2.1.2 1999年 Troesch等［15］基于16SrRNA 和rpoB基因序列，利用基因芯片技术鉴定出70株27种不同菌种的分枝杆菌临床分离株和15株耐利福平菌株，结果正确地鉴定了27个种属中的26个，而且检测出了所有耐利福平的15株结核分枝杆菌rpoB突变基因。

2.1.3 2002年张万江等［16］报道应用基因芯片技术检测1株结核分枝杆菌药物敏感株和4株耐多药株结核分枝杆菌，基因芯片扫描结果经分析与传统药敏检测结果相符合。

2.1.4 2003年崔振玲等用［17］芯片检测耐异烟肼分离株katG、ahpC调节区域和inhA调节区域的基因突变。同年，端木和运等［18］报道应用基因芯片检测20株耐INH、RFP结核分枝杆菌临床分离株的katG、rpoB基因突变；李胡渤等用 DNA［19］芯片对59株耐药结核分枝杆菌进行耐异烟肼、耐利福平基因进行检测。

2.2 基因芯片技术应用于耐多药结核病（MDRTB）检测的现状

至今为止，经过各国科研工作者的共同努力，已经鉴定出的结核分枝杆菌耐药相关基因如下表1［20－24］。

表1 结核分枝杆菌耐药相关基因

3 展望

尽管基因芯片技术发展的时间还不长，在各个科学领域还未广泛深入，应用过程中存在这样那样不可预知的问题，但由于其自身的诸多特性，使得这项技术有着巨大的潜能，相信随着科学工作者不断的追求和探索，基因芯片技术一定会在生命科学研究领域创造辉煌的成就。

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