ZHX2基因在肝细胞癌中表达水平及其临床意义

徐洪彪，曹 宏，陈学博，赵红蕾，孙月芳，田晓丰＊

（1.松原市乾安县医院 普外科，吉林 松原131400；2.吉林大学第二医院 普外科中心；3.吉林大学 畜牧兽医学院）

人 类 同 源 框 （zinc－fingers and homeoboxes，ZHX）蛋白家族，包括ZHX1、ZHX2和ZHX3，分子结构中均包括2个锌指结构（zinc－finger motifs）和5个同源结构域（homeodomains，HDs）。3种蛋白自身可组成同源二聚体，2种蛋白相互之间也可形成异源二聚体。ZHX蛋白家族在组织中广泛存在，作为转录抑制因子发挥重要的病理生理功能。ZHX2是ZHX蛋白家族成员之一，是2003年新克隆的转录抑制因子，位于染色体8q24.13，含有2个锌指结构和5个同源结构域，其编码的蛋白含837个氨基酸残基，定位于细胞核内［1］。近年来的研究结果显示，ZHX2参与正常肝细胞中肝癌标志物的转录抑制，提示ZHX2的表达缺失可能是肝细胞癌（HCC）发生的关键因素［2］。以往的研究大多采用免疫组织化学染色或RT－PCR半定量技术，这些方法在定量方面仍有缺陷。实时荧光定量PCR技术是用于mRNA扩增定量检测的一项新技术，与RTRCR半定量分析、Northern印迹法等传统mRNA定量方法相比，具有特异性高、稳定性好和高通量等优点。本研究通过实时定量检测肝癌组织中ZHX2基因的表达情况，并同癌旁组织比较，分析其相对表达水平与肝癌临床病理分级的关系，旨在为肝癌的临床诊断、治疗及预后提供依据。

1 材料与方法

1.1 病例选择

选择2009年3月到2010年5月吉林大学第二附属医院首诊的24例肝癌患者为研究对象，收集手术切除的肝癌新鲜癌组织标本，取6例胆管结石手术切除的正常肝组织为对照，标本均经病理验证，所有研究对象均有知情同意权。标本于手术摘除后5分钟内采集，生理盐水冲洗后立即液氮保存。收集全部HCC患者的年龄、性别、肿瘤大小、病理分级（Edmondson标准）、血清AFP水平、门静脉癌栓和肝病背景等临床资料。

1.2 仪器和试剂

Trizol Reagent、Platinum SYBR Green qPCR SuperMix UDG试剂盒均购自美国Invitrogen公司；Omniscirpt RT反转录试剂盒购自德国Qiagen公司；ABI 7500荧光定量PCR仪为美国ABI公司产品。引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。

1.3 引物及探针的设计

根据GenBank中ZHX2的基因序列（gi：63079684），利用Primer Premier 5.0软件辅助分析设计引物，ZHX2产物大小为194bp，上游引物为5’－GCCAGTGACCGCAAGAAGA－3’；下游引物为5’－GATTCGCTGGTGATGTGG－3’。由宝生物工程（大连）有限公司合成。

为对ZHX2mRNA的测定含量进行标准化，使之具备可比性，需设置内参照。GAPDH在各类组织细胞内的转录水平较为恒定，故以GAPDH作为内参照。GAPDH产物大小为146bp，上游引物为5’－TCATGGGTGTGAACCATGAGAA－3；下游引物为5’－GGCATGGACTGTGGTCATGAG－3’。

1.4 总RNA的提取

采用Trizol法提取组织总RNA，所提取的RNA立即进行反转录操作，方法按照Omniscirpt RT反转录试剂盒说明书进行，得到的cDNA保存于－20℃。

1.5 实时定量PCR检测

逆转录和PCR反应严格按照试剂盒操作说明进行。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃、10s，60℃、45s，70℃、15s共40个循环；循环结束后95℃、10s，65℃延伸1min。温度每上升1℃取5次荧光值制作熔解曲线，确定扩增产物的特异性。在相同反应条件下进行ZHX2及GAPDH mRNA检测，如果熔解曲线显示无基因扩增特异性信号，则认为其不表达该基因。每个反应设4个复孔，结果为3次实验的平均值。

1.6 结果判断及统计学处理

RT－PCR扩增曲线阳性标本呈现典型的S型曲线，而阴性对照是一条不规则的波浪线。荧光定量检测结果用SDS软件进行分析，并用RQ＝2－ΔΔCt公式计算相对表达，Ct为循环阀值，ΔCt＝样品Ct均值－内参照Ct均值，ΔΔCt＝ΔCt－（随机阴性对照样品Ct均值－该样品内参照Ct均值），以2－ΔΔCt表示样品中目的基因初始cDNA相对表达量。结果用SPSS 13.0统计软件进行分析。

2 结果

2.1 肝组织总RNA提取结果

标本经Trizol法提取总RNA后，分别测定A260／A280，总体比值范围在1.73±0.24，说明总RNA质量较好。经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见清晰的28s和18s主带，说明总RNA无降解，无DNA污染，如图1所示。

图1 组织标本总RNA提取结果

2.2 FQ－PCR结果

ZHX2mRNA的RT－PCR扩增曲线呈现典型的S型曲线（图2A），熔解曲线分析可见只有单峰值，排除了非特异性扩增（图2B）。内参GAPDH mRNA的RT－PCR扩增曲线也呈现典型的S型曲线（图2A），熔解曲线分析可见只有单峰值，排除了非特异性扩增（图2B）。表明所建立的ZHX2mRNA的荧光定量方法特异性较好。

2.3 HCC组织及癌旁肝组织中ZHX2基因mRNA的表达

图2 ZHX2及GAPHD FQ－PCR结果

图3 组织样品ZHX2及GAPHD FQ－PCR结果

HCC组织及癌旁肝组织中ZHX2基因mRNA的表达检测结果如图3所示，在6例正常肝组织中均有表达；在HCC癌组织中ZHX2mRNA的阳性率为33.3%（8／24），癌旁非瘤组织中ZHX2mRNA的阳性率为62.5%（15／24）；ZHX2mRNA 在 HCC及癌旁组织中的阳性表达率无差异（χ2＝0.2432，P＞0.05）；但ZHX2mRNA在 HCC组织中的表达明显低于对应的癌旁肝组织，差异具有显著性（P＜0.05，表1）。

表1 HCC及癌旁组织中ZHX2基因mRNA表达的分析

2.4 ZHX2的表达与HCC临床病理特征的关系

将HCC按不同的临床病理特征分组比较ZHX2mRNA的表达，结果显示，ZHX2mRNA的表达与HCC患者的性别、年龄、分化程度、肿瘤大小、有无静脉浸润以及肝硬化程度无关，而与有无肝外转移灶、HBV感染和血清AFP值有关（表2）。

在所取的24例肝癌中，有2例门静脉主干癌栓和2例肝门部淋巴结转移灶。对这4例HCC转移灶的检测显示，其ZHX2基因mRNA的表达水平较HCC肝内病灶高，差异有显著性（P＜0.01）。

对收集的24例HCC标本按HBV感染情况进行分类，检测两组中ZHX2的mRNA水平，检测结果经软件分析，以GAPDH为内对照，统计分析结果显示，HBV阳性组中ZHX2的整体表达水平低于 HBV阴性组（P＜0.01）。

表2 ZHX2mRNA的表达与HCC临床病理特征的关系

ZHX2mRNA与AFP血清水平呈负相关关系，ZHX2mRNA在血清AFP＜400ng／ml的HCC组织中的表达水平明显高于血清AFP≥400ng／ml的 HCC组织（P＜0.01）。

3 讨论

ZHX2mRNA长度约4.4kb，在肝、脑、肺等组织中均广谱表达，但其在卵巢、前列腺、骨骼肌、脾、胰组织中表达水平相对更高［3］。近期研究显示ZHX2可能参与多种疾病的发生发展，ZHX2不仅抑制肝癌细胞AFP的表达，而且在肾病综合征中参与肾小球内足细胞的调控［4］，另有研究显示ZHX2表达与多发性骨髓瘤恶性程度及患者预后呈负相关［5］。上述研究提示ZHX2可能成为一个重要的抑癌基因。

本研究发现，ZHX2基因的mRNA在正常肝组织中均有表达，ZHX2mRNA在HCC及癌旁组织中的阳性表达率无差异，但ZHX2mRNA在HCC组织中的表达明显低于对应的癌旁肝组织；ZHX2 mRNA的表达与HCC患者的性别、年龄、分化程度、肿瘤大小、有无静脉浸润以及肝硬化程度无关，而与有无肝外转移灶、HBV感染和血清AFP值有关。ZHX2基因mRNA在肝外转移灶和门静脉主干癌栓中表达升高。本研究检测了ZHX2mRNA的表达，结果表明ZHX2基因mRNA的表达在HCC中高于癌旁肝组织，其在低分化HCC中的表达高于高分化HCC，这提示ZHX2基因可能不仅与肝癌的发生有关，而且与肝癌的恶性程度也有关。本研究结果提示，ZHX2基因参与了HCC的发生和发展，同时ZHX2基因的过量表达与HCC的侵袭和转移密切相关，ZHX2基因有可能成为反映HCC侵袭转移能力的新指标。

应用定量PCR技术检测目的基因mRNA定量表达，其前提是样本间细胞起始数、RNA提取效率、反转录效率和目的基因扩增效率均需相同，然而以上条件不可能同时满足，必须用管家基因对样本进行标准化，管家基因在细胞或基因组中的拷贝数被视为恒定，可用于代表样本中所含细胞或基因组的数量［6］。本研究首次利用定量PCR检测ZHX2基因mRNA在HCC中的表达水平，发现尽管ZHX2在HCC及癌旁组织中均有较高的表达频率，但HCC中ZHX2mRNA水平明显低于对应的癌旁组织。

ZHX2广泛表达于哺乳动物不同组织，其表达调控机制迄今尚不清楚。2006年，lv等［7］在研究HCC甲基化过程中发现了在多数HCC组织标本中存在的一个广泛的甲基化区域，同源性分析证实该区域是ZHX2启动子区；进一步实验证实HepG2细胞中去甲基化可以恢复ZHX2表达，提示甲基化是ZHX2表达调控的机制之一。本课题组对ZHX2与HCC发病机制研究中，同时采用变性高效液相色谱法对HCC中ZHX2启动子区域甲基化水平与ZHX2mRNA表达水平及与HCC发生发展相互关系进行了研究（另文发表），结果发现在正常肝组织未检测到ZHX2基因启动子区域甲基化，而24例HCC癌组织中有11例（45.8%）存在甲基化，提示该甲基化是肿瘤相关性的。另外，有16.6%癌旁肝组织也能检测到甲基化，但明显低于癌组织，有可能是由于癌旁肝组织存在不同程度的肝硬化或慢性炎症，而并非完全正常肝组织，但也说明该甲基化有可能在HCC发生的早期或者其癌前病变时就已经出现。

［1］Kawata H，Yamada K，Shou Z，et al.fingers and homeoboxes（ZHX）2，a novel member of the ZHX family，functions as a transcriptional repressor［J］.Biochem J，2003，373（Pt 3）：747.

［2］Yamada K，Ogata－Kawata H，Matsuura K，et al.ZHX2and ZHX3repress cancer markers in normal hepatocytes［J］.Front Biosci，2009，14（1）：3724.

［3］Wienk H，Lammers I，Hotzo A，et al.The tandem zinc－finger region of human ZHX adopts a novel C2H2zinc finger structure with a C－terminal extension［J］.Biochemistry，2009，48（21）：4431.

［4］Liu C，Clement L C，Kanwar Y S，et al.ZHX proteins regulate podocyte gene expression during the development of nephritic syndrome［J］.Biol Chem，2007，281（51）：39681.

［5］Armelliui A，Sarasquete M E，Curca－Suuz R，et al.Low expression of ZHX2，but not RCBTB2or RAN，is associated with poor outcome in multiple myeloma［J］.Br J Haematol，2008，141（2）：212.

［6］Huggett J，Dheda K，Bustin S，et al.Real time RT－PCR normalization：strategies and considerations［J］.Gene and Immunity，2005，6（4）：279.

［7］Lv Z，Zhang M，Bi J，et al.Promoter hypermethylation of a novel gene，ZHX2，in hepatocellular carcinoma［J］.Am J Clin Pathol，2006，125（5）：740.