慢病毒介导的RNA干扰增殖诱导配体基因抑制胃癌细胞增殖

蒿姗姗，李 薇，王 畅，崔久嵬

（吉林大学第一医院 肿瘤中心，吉林 长春130021）

胃癌（GC）是世界第二大致癌症相关死亡的最常见的原因之一，也是我国最常见的恶行肿瘤之一。近年来，胃癌的发病呈上升趋势，探讨其发病机制对其诊治具有重要意义。

增 殖 诱 导 配 体 （APRIL）（又 称 TALL－2，TRDL1，或TNFSF13）是肿瘤坏死因子（TNF）家族的一个成员。它最初确定是1998年由Hahne等［1］首先发现，因刺激肿瘤细胞的增殖而得名。APRIL在正常组织的表达很弱，但在多种肿瘤细胞和组织，如肺癌、黑色素瘤［2］，特别是胃肠道肿瘤有高水平表达［1，3］。在本项研究中，我们通过构建 APRIL siRNA慢病毒载体并转染人胃癌MGC803细胞，观察其对MGC803细胞增殖及细胞周期的影响，以探讨其在胃癌发病中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

人胃癌细胞系 MGC803（购自ATCC）；大肠杆菌菌株DH5α、293T细胞（本实验室保存）；RPMI 1640培养液、胎牛血清（Gibco公司）；M－MLV逆转录酶（Promega公司）；Lipofectamine 2000、Trizol试剂盒（Invitrogen公司）；限制性内切酶、PCR试剂盒 （TaKaRa公 司）；MTT、核 糖 核 酸 酶 （Sigma－Aldrich公司）；慢病毒载体pLVTHM、psPAX2、pMD2.G（均购自Biovector Science Lab）。

1.2 方法

1.2.1 APRIL siRNA慢病毒载体质粒的设计与构建 根据人APRIL基因mRNA序列（NCBI Reference Sequence：NM＿172088.1），通过siRNA“Target Finder Tool”设计软件（GenScrip公司网站提供）设计针对目的基因ARPIL的干扰序列：5’－aaTCCAGGATGCTGGAGTTTA－3’，同时设计阴性 对 照 序 列 （nonsilencing，NS）：5’－TTCTCCGAACGTGTCACGT－3’。通 过 BLAST 同 源 性分析，排除了干扰序列非特异性抑制其他基因序列的可能。用化学合成法合成DNA寡核苷酸，退火，并插入到包含绿色荧光蛋白（GFP）的慢病毒载体pLVTHM中，最后将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布平板，37℃过夜培养。对长出的单克隆菌落进行PCR鉴定，并通过限制性内切酶分析及DNA测序鉴定。

1.2.2 细胞培养与慢病毒的制备与转染 人胃癌细胞MGC803和293T细胞，于含有10%胎牛血清、100U／ml青霉素和100mg／ml链霉素的RPMI 1640培养基，37℃，5%CO2饱和湿度培养箱内孵育。按Lipofectamine 2000使用说明，将重组的慢病毒质粒与辅助载体共转染293T细胞。转染48h后，收集含有APRIL siRNA和非特异性序列的siRNA慢病毒颗粒的细胞上清液，然后确定此病毒的滴度。测得MGC803细胞在重组慢病毒转染3天后的感染复数（MOI）为20。

1.2.3 RT－PCR 检测 APRIL mRNA 的表达 应用Trizol试剂盒，按照试剂盒说明书对MGC803细胞提取总RNA。根据说明书，加入M－MLV逆转录酶42℃，反应60min。APRIL mRNA的表达通过SYBR green PCR master mix分析，反应如下：95℃15s，95℃5s，45个循环，60℃30s。引物设计如下：APRIL正义链：5＇－GGTATCCCTGGCAGAGTC－3＇；反义链：5＇－CTGTCACATCGGAGTCATC－3’和humanβ－actin：正 义 链：5＇－GGCGGCACCACCATGTACCCT－3＇；反 义 链：5＇－AGGGGCCGGACTCGTCATACT－3＇。以管家基因β－actin APRIL的循环阈值为标准对照，测定APRIL的表达。所有实验均重复3次。

1.2.4 MTT比色法检测细胞增殖 取Lenti－siAPRIL和Lenti－NS转染的胃癌细胞，分别接种于96孔培养板，每孔100μl（含细胞数为2 000），每组均设3个复孔。于CO2培养箱中培养至第1，2，3，4和第5天后，各孔分别加入20μl（5mg／ml）的MTT，继续孵育4h。吸弃培养上清，加入150μl二甲基亚砜（DMSO），充分混合10min，用酶标仪于570nm处测定OD值。计算各组3个复孔的平均值，绘制计算细胞生长曲线。

1.2.5 流式细胞仪分析细胞周期变化 收集转染效率在80%以上的细胞，用D－Hanks液清洗，70%的预冷乙醇固定，4℃，1h。PBS洗涤2次，加入50 μg／ml的PI和100μg／ml的 RNase，室温，避光5 min后，用流式细胞仪测定，实验重复3次。

1.2.6 统计分析 采用SPSS13.0软件，组间比较用方差分析，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 荧光显微镜观察重组慢病毒转染的效率

重组慢病毒转染MGC803细胞72h后，通过荧光显微镜可观察转染成功的细胞，在470－490 nm光激发下发出绿色荧光（图1）。转染效率超过90%，说明慢病毒包装成功，且转染效率较高。

图1 荧光显微镜观察重组慢病毒转染的效率

2.2 Lenti－siAPRIL对APRIL基因表达的影响

本研究对非特异序列载体转染组和Lenti－siAPRIL的APRIL mRNA表达水平进行了检测。如图2所示：Lenti－siAPRIL转染MGC803细胞的APRIL mRNA水平均显著减少68.1%（P＜0.01）。

2.3 Lenti－siAPRIL对细胞增殖的影响

Lenti－siAPRIL转染的 MGC803细胞与Lenti－NS转染的细胞分别在第2，3，4和5天后检测细胞增殖情况。细胞生长曲线显示（图3）：与Lenti－NS组相比，Lenti－siAPRIL转染细胞组的增殖能力明显下降（P＜0.05）

图2 RT－PCR对APRIL基因干扰效果的检测

图3 MTT实验检测细胞增殖

2.4 Lenti－siAPRIL对细胞周期的影响

我们对 Lenti－NS转染组和 Lenti－siAPRIL 转染组转染3d后进行了流式细胞仪细胞周期检测，结果如图4所示。在图4中，与对照组相比，Lenti－siAPRIL组的细胞在S期和G2／M期细胞周期阶段的百分比增加；而在G0／G1期细胞比例显著降低。提示Lenti－siAPRIL组胃癌细胞增殖被阻滞在G2／M期。

图4 流式细胞仪检测细胞周期

3 讨论

目前，胃癌仍然是威胁人类健康的重要杀手，在缺乏对胃癌的早期诊断和检测策略的情况下，胃癌的预后仍然较差［4］。在癌症发展过程中，基因异常经常可以监测到，例如：基因突变或者参与肿瘤的生存、发展和转移的基因扩增。对于胃癌，一系列特定基因（癌基因和抑癌基因）突变已被发现，其中包括APRIL 基因［5］。

APRIL作为肿瘤坏死因子（TNF）家族的新成员，它在动物模型中显示出促进肿瘤增殖的作用，例如：APRIL过度表达诱导B细胞淋巴瘤［6］。然而，APRIL促进肿瘤增殖并不局限于B细胞淋巴瘤。事实上，APRIL对实体瘤也提供生存／增殖信号。虽然并未在体外检测到，但这种APRIL在肿瘤细胞过表达的现象，已在体内观察到［7－9］。

RNA干涉（RNAi）是双链 RNA（double－stranded RNA，dsRNA）引发的转录后基因沉默。以某个基因为靶标的dsRNA被导入宿主细胞，可以使其mRNA发生特异性降解，导致相应的基因沉默［10］。慢病毒是一种逆转录病毒，其最大的特点是转染分裂期细胞的同时，还可以转染非分裂期细胞，并可在宿主体内长期表达［11］。

在这项研究中，实验结果表明，我们构建的Lenti－siAPRIL慢病毒质粒能有效地转染人胃癌MGC803细胞。与非特异序列转染组相比，LentisiAPRIL组显著抑制了APRILmRNA表达；同时，Lenti－siAPRIL能抑制细胞增殖，提示：APRIL可调节GC细胞的增殖。此外，APRIL基因的沉默导致在S期和G2／M期细胞比例显着增加，这表明，APRIL siRNA抑制细胞增殖，通过将细胞阻滞在G2／M期。APRIL通过调节细胞周期发挥其作用，这种调节作用的进一步研究，将有助于我们更好地理解胃癌的分子机制。

综上所述，我们成功构建了人APRIL慢病毒siRNA干扰载体，且验证了慢病毒介导的RNA干扰能够有效抑制APRIL的表达。慢病毒介导的siRNA有效地抑制细胞增殖，且细胞周期被阻滞在G2／M期。该研究对后继的APRIL基因为靶点的胃癌的治疗研究奠定了基础。

［1］Hahne M，Kataoka T，Schroter M，et al.APRIL，a new ligand of the tumor necrosis factor family，stimulates tumor cell growth［J］.J Exp Med，1998，188（6）：1185.

［2］Yaccoby S，Pennisi A，Li X，et al.Atacicept（TACI－Ig）inhibits growth of TACI（high）primary myeloma cells in SCID－hu mice and in coculture with osteoclasts［J］.Leukemia，2008，22（2）：409.

［3］Kelly K，Manos E，Jensen G，et al.APRIL／TRDL－1，a tumor necrosis factor－like ligand，stimulates cell death［J］.Cancer Res，2000，60（4）：1026.

［4］Resende C，Ristimaki A，Machado JC.Genetic and epigenetic alteration in gastric carcinogenesis［J］.Helicobacter，2010，15（1）：35.

［5］Chiu A，Xu W，He B，et al.Hodgkin lymphoma cells express TACI and BCMA receptors and generate survival and proliferation signals in response to BAFF and APRIL［J］.Blood，2007，109（2）：737.

［6］Chu VT，Enghard P，Riemekasten G，et al.In vitro and in vivo activation induces BAFF and APRIL expression in B cells［J］.J Immunol，2007，179（9）：5956.

［7］Mhawech－Fauceglia P，AllaAl，Odunsi K，et al.Role of the tumour necrosis family ligand APRIL in solid tumour development：Retrospective studies in bladder，ovarian and head and neck carcinomas［J］.European journal of cancer，2008，44（15）：2099.

［8］Wang F，Ding W，Wang J，et al.Identification of microRNA－target interaction in APRIL－knockdown colorectal cancer cells［J］Cancer Gene Therapy，2011，18（7）：507.

［9］Roosnek E，Burjanadze M，Dietrich PY，et al.Tumors that look for their springtime in APRIL［J］.Crit Rev Oncol Hematol，2009，72（2）：95.

［10］Romano G.Current development of lentivial－mediated gene transfer［J］.Drug News Perspect，2005，18（2）：132.

［11］Fish RJ，Kruithof EK.Short－term cytotoxic effects and longterm instability of RNAi delivered using lentiviral vectors［J］.BMC Mol Biol，2004，5：9.