乳腺癌耐药蛋白BCRP表达与化疗药物敏感性的关系

张 琼 谭小军 郑国沛

1.广州医学院附属肿瘤医院病理科，广东广州 510095；2.广州医学院肿瘤研究所，广东广州 510095

乳腺癌耐药蛋白BCRP表达与化疗药物敏感性的关系

张 琼1谭小军1郑国沛2

1.广州医学院附属肿瘤医院病理科，广东广州 510095；2.广州医学院肿瘤研究所，广东广州 510095

目的 探讨乳腺癌组织中乳腺癌耐药蛋白表达与临床常用化疗药物敏感性之间的关系。 方法 选取42例乳腺癌组织标本，采用免疫组织化学S-P法检测标本中BCRP表达，对同一标本应用胶滴肿瘤药敏检测技术进行体外药物敏感性试验。 结果 乳腺癌组织中BCRP阳性表达率为33.33%（14/42），BCRP阳性表达者中5-氟尿嘧啶、阿霉素耐药组所占比例明显高于BCRP阴性组（P＜0.05）。 结论 BCRP蛋白表达可以作为预测化疗效果的一个重要参考指标，根据药物敏感试验结果进行药物筛选，实现乳腺癌化疗的个体化，对于提高患者生存质量，具有十分特殊的意义。

乳腺癌；乳腺癌耐药蛋白；胶滴肿瘤药敏检测技术

近年来我国乳腺癌的发病率明显增高，位居女性恶性肿瘤的首位。乳腺癌易于转移至外周淋巴结，其复发率和死亡率较高。虽然现代外科学手术方法取得了极大进展，但是对术后复发或转移尚缺乏有效手段。化疗是一种重要的辅助治疗方法，但肿瘤细胞多药耐药常导致化疗失败。研究发现乳腺癌耐药蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）与多种肿瘤的多药耐药密切相关[1]。本研究采用免疫组织化学S-P法检测乳腺癌标本中BCRP表达，对同一标本应用胶滴肿瘤药敏检测技术（collagen gel droplet culture drug-sensitivity test，CD-DST）进行体外药物敏感性试验，为优化临床乳腺癌治疗方案提供有指导意义的信息。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取笔者所在医院2011年1～7月行乳腺癌根治术的42例乳腺癌患者作为研究对象。患者年龄23～78岁，平均（48.2±13.7）岁；病理类型：浸润性导管癌35例，浸润性小叶癌4例，其他类型3例；临床分期：Ⅰ期5例、Ⅱ期23例、Ⅲ期11例、Ⅳ期3例。所有患者术前均未经化疗、放疗及免疫治疗。

1.2 试剂和仪器

一抗为鼠抗人BCRP单克隆抗体，购自德国Merck公司，S-P试剂盒购自北京中杉金桥生物公司。RPMI-1640培养基、胎牛血清购自Gibco公司；鼠尾胶原蛋白Ⅰ型购自北京鸿跃科技有限公司；紫杉醇、5-氟尿嘧啶、阿霉素、环磷酰胺均购自国内制药厂。Image-Pro Plus图像分析系统（media cybernetics，USA）。

1.3 病理学检查

乳腺癌手术切除标本经中性福尔马林固定后，在肉眼所见肿瘤实体无出血坏死处取材后进行脱水、包埋等常规组织学处理；石蜡包埋后进行连续切片，切片厚5 μm，一张HE染色后用于组织病理学的诊断，其余用于免疫组织化学分析。

1.4 方法

1.4.1 蛋白检测 采用免疫组化S-P法，操作按试剂盒说明书进行。PBS代替一抗为阴性对照，用已知阳性切片作阳性对照。

1.4.2 免疫组化结果判定标准 BCRP蛋白免疫反应以胞膜和胞质呈现棕黄色颗粒为阳性，结果判定采用Fromowitz[2]综合计分法 ：（1）染色强度评分：无染色为0分，呈淡黄色颗粒、明显高于背景为1分，呈浅棕黄色颗粒为2分，出现大量深棕黄色颗粒为3分；（2）阳性细胞数评分：所有切片随机观察5个高倍视野（×400），计数500个细胞中染色阳性细胞数，阳性细胞数＜5%为0分；阳性细胞数5%～25%为1分；26%～50%为2分；51%～75%为3分；＞75%为4分。染色强度评分与阳性细胞数比例的评分相加之和＜2为阴性（-），2～ 3分为弱阳性（+），4～ 5分为中度阳性（++），6～ 7分为强阳性（+++）。

1.4.3 CD-DST试验 无菌条件下将新鲜乳腺癌标本剪成0.5～1.0 mm组织碎块，组织消化酶消化后筛网过滤，离心后去除上清液，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基制成细胞悬液。冰浴条件下制备胶原蛋-细胞混合溶液，接种于24孔细胞培养板。培养24 h后，参照各抗癌药物血浆高峰浓度加入培养液继续培养24 h，同时设不加药空白对照孔。甲基紫染色，甲醛固定后，倒置显微镜拍照，并利用图像分析软件自动计算肿瘤细胞数量。

1.4.4 CD-DST结果判定 药物处理组细胞数/空白对照组细胞数的百分比表示药物体外敏感性，如果该百分比≤50%判定为药物在体外敏感。

1.5 统计学处理

应用SPSS15.0统计软件对数据进行分析，计数资料采用x2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌组织中BCPR的表达情况

乳腺癌组织中BCRP阳性表达率为33.33%（14/42）， 其中强阳性3例，中等强度阳性8例，弱阳性3例。见图1。

图1 BCRP在乳腺癌组织中的表达（SP，×200）

2.2 胶滴肿瘤药敏检测结果

BCRP阳性表达者中5-氟尿嘧啶、阿霉素耐药组所占比例明显高于BCRP阴性组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

3 讨论

迄今为止，乳腺癌的临床治疗仍然是以手术为主，辅以放疗、化疗和内分泌治疗等。化疗以能控制微小转移，术前缩小原发灶，术后防止复发转移以及失去手术机会的姑息治疗等特点而在乳腺癌综合治疗中彰显出不可替代的作用。但乳腺癌的多药耐药一直影响化疗效果。多药耐药的形成机制复杂，涉及多个因素、多个环节及多条途径，目前研究最深入的是ATP结合盒式（ATP binding cassette，ABC）超家族成员等膜转运蛋白表达增高而介导的多药耐药。BCRP是ABC超家族中的新成员，与典型的转运蛋白不同的是只含有一个结合结构域和一个疏水性的跨膜结构域，因此称其为半转运蛋白，主要通过水解ATP供能将细胞内的药物泵出，降低细胞内药物浓度从而导致耐药[3]。本研究结果显示，42例乳腺癌中BCRP蛋白阳性表达14例，阳性表达率为33.33%，与孙宇萍等[4]检测60例临床乳腺癌标本组织中BCRP阳性表达率为35%基本相近。

近年来研究证明BCRP在白血病[5]、肺癌[6]等许多恶性肿瘤的多药耐药中扮演着重要角色。越来越多的实验资料显示，BCRP通过形成同源二聚体或异源二聚体在乳腺癌细胞对米托蒽醌、托普替康、5-氟尿嘧啶等多种药物的耐受中发挥着重要作用[7-8]。袁建辉等[9]利用四环素（tetracycline，Tet）调控BCRP体外表达的鼠成纤维细胞PA317细胞模型（PA317/Tet on/TRE-BCRP）研究发现，随着细胞BCRP表达的增加，PA317/Tet on/TRE-BCRP细胞对5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、多柔比星、 吡柔比星、依托泊苷、米托蒽醌等药物的耐药指数增高，并且经5-氟尿嘧啶处理后细胞凋亡率随之降低，证实了BCRP介导的5-氟尿嘧啶多药耐药机制除了将药物“泵出”细胞外，还能增强细胞对凋亡的耐受。颜红柱等[10]报道，浸润性乳腺癌中BCRP的表达与ER呈负相关。Imai等[11]研究发现，ER阳性的乳腺癌细胞株中，雌激素能降低内源性BCRP的表达，但在ER阴性的细胞中却无此作用。Wakabayashi等[12]也发现雌二醇可以下调ERα阳性的乳腺癌细胞中BCRP表达。但Ee PL等[13]报道，ER阳性的乳腺癌细胞株中雌激素可以诱导BCRP mRNA表达增强，与前述研究结果相矛盾。以上结果表明，乳腺癌BCRP表达水平可能受雌激素－雌激素受体信号通路的影响，但其具体机制复杂，有待于进一步探讨。

本研究分析了乳腺癌组织中BCRP的表达与临床常用乳腺癌化疗药物敏感性的关系，发现在BCRP阳性表达的14例患者中5-氟尿嘧啶和阿霉素耐药组所占比例明显高于BCRP阴性组，提示BCRP参与了乳腺癌对上述药物多药耐药的形成。本研究结果表明，BCRP蛋白表达可以作为预测化疗效果的一个重要参考指标，为在BCRP阳性的乳腺癌患者化疗中避免使用这些耐受药物起到十分重要的指导作用。根据药物敏感试验结果进行药物筛选，实现乳腺癌化疗的个体化，改观化疗效果，对于提高患者生存质量和生存率、避免不必要的化疗药物副作用，具有十分特殊的意义。

表1 乳腺癌组织中BCPR表达与化疗药物敏感性的关系[n（%）]

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Correlation between the expression of breast cancer resistance protein BCRP and chemotherapy drugs sensitivity

ZHANG Qiong1TAN Xiaojun1ZHENG Guopei2
1.Department of Pathology,Guangzhou Medical University Cancer Hospital,Guangzhou 510095,China;2.Guangzhou Medical University Cancer Institute,Guangzhou 510095,China

ObjectiveTo explore the correlation between the expression of breast cancer resistance protein BCRP and the sensitivity to chemotherapeutic drugs commonly used in clinical.Methods42 cases of breast cancer tissue samples were selected. The expression of BCRP protein was detected in breast cancer tissues using S-P staining method. In vitro drug sensitivity tests were carried out on the same sample using collagen gel droplet culture drug-sensitivity test (CD-DST).ResultsThe positive expression rate of BCRP was 33.33%(14/42).Significantly higher 5-Fluorouracil and Adriamycinresistance rates were revealed in BCRP positive group than those in BCRP negative group (P＜0.05).ConclusionBCRP protein expression can be used as an important reference index for predicting the effect of chemotherapy. It is of special significance to implement individual breast cancer chemotherapy and improve the quality of life in patients with breast cancer according to the drug sensitivity test results.

Breast cancer;BCRP;CD-DST

R737.9

A

2095-0616（2012）11-12-03

广东省广州市医药卫生科技项目（201102A213008）。

2012-04-10）