糯米蛋白提取工艺优化及其水解物性质的测定

王国泽，袁怀波，徐建文

(1.内蒙古科技大学数理与生物工程学院，内蒙古包头014010; 2.合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽合肥230009)

糯米蛋白提取工艺优化及其水解物性质的测定

王国泽1，袁怀波2，*，徐建文2

(1.内蒙古科技大学数理与生物工程学院，内蒙古包头014010; 2.合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽合肥230009)

以糯米为原料，采用碱性蛋白酶水解法提取了糯米蛋白。就影响糯米蛋白提取率的5个因素:料液比(g/mL)、加酶量(E/S)、pH、温度和提取时间进行单因素实验和正交实验。研究确立了提取糯米蛋白的最佳工艺条件为料液比1∶12，加酶量2%，pH 9，温度45℃，提取时间3h。在此条件下，糯米蛋白的提取率可达8.529%。实验表明，糯米蛋白水解物是一类天然的抗氧化氨基酸及其聚合物。

糯米蛋白，提取工艺，抗氧化性

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

糯米 蚌埠市兄弟粮油食品科技有限公司提供;盐酸(0.1mo1/L)、氢氧化钠(0.1mol/L)、无水乙醇、1，1－二苯基－2－三硝基苯肼(DPPH)、无水乙醇、FeSO4、H2O2、水杨酸钠、磷酸盐缓冲液(pH=6.6)、铁氰化钾(1%)、三氯乙酸(10%)、三氯化铁(0.1%)、维生素C(VC)、考马斯亮蓝G－250试剂 分析纯，天津天津风船化学试剂科技有限公司;酸性蛋白酶(活力单位50000U/g)、碱性蛋白酶(活力单位100000U/g)、木瓜蛋白酶(活力单位50000U/g)、中性蛋白酶(活力单位50000U/g)及复合蛋白酶(活力单位50000U/g)天津利华酶制剂有限公司。

KA－1000型台式离心机 上海安亭科学仪器厂;JA1003型电子天平 奥豪斯(上海)公司;THZ－92A型恒温水浴锅 江苏金坛环宇科学仪器厂;THZ－92A型恒温气浴漩涡振荡器 上海浦东物理光学仪器厂;752型紫外可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司;JC101型电热鼓风干燥箱 上海成顺仪器仪表有限公司;FZ102型微型植物试样粉碎机 河北黄骅市齐家务科学仪器厂;BCD－192ACM型冰箱美的集团电冰箱制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 糯米样品制备 糯米→37℃干燥6h→磨碎过40目筛→糯米样品。

1.2.2 糯米蛋白提取工艺 碱提取法工艺流程:糯米样品→调pH→恒温气浴中碱解→离心(3000r/min，10min)→上清液→调节等电点酸沉→离心(3000r/min，10min)→沉淀→冷冻干燥→糯米蛋白。

酶法提取工艺流程:糯米样品→加水到预定量→调节pH→加入预定量的酶→恒温气浴中酶解→离心(3000r/min，10min)→取上清液→灭酶→真空浓缩→冷冻干燥→糯米蛋白。

1.2.3 正交实验设计 正交实验优化糯米蛋白提取工艺所选取的因素和水平见表1。

表1 L9(33)正交实验因素和水平Table 1 Factors and levels in L9(33)orthogonal array design

1.2.4 蛋白质提取率计算 采用考马氏亮蓝法［14］测定上清液中的蛋白质含量。

糯米蛋白提取率(%)=上清液蛋白质的质量(g)/样品质量(g)×100%。

1.2.5 糯米蛋白水解物抗氧化性测定 采用碱性蛋白酶提取最佳工艺制备糯米蛋白，再利用木瓜蛋白酶在pH=7，温度60℃条件下对所制备的糯米蛋白进行酶解制备糯米蛋白水解物，测定糯米蛋白水解物的DPPH自由基［15］和羟自由基清除能力及其还原能力。

2 结果与分析

2.1 四种蛋白酶与碱法提取糯米蛋白的比较

设定料液比1∶10、加酶量2%，调节酸性蛋白酶、复合蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶在各自最适温度和pH对糯米蛋白进行水解，对比四种蛋白酶与最优工艺条件下碱法提取糯米蛋白的提取率，结果见图1。

由图1可以看出，酸性蛋白酶的提取率仅为1.940%;中性蛋白酶提取率与复合蛋白酶提取率为5.500%左右，相差不大，碱法提取率较高为7.132%，而碱性蛋白酶提取率为7.834%。通过比较可知碱性蛋白酶是进行糯米蛋白提取实验最佳选择。

图1 糯米蛋白提取率的比较Fig.1 The comparison on extraction rate of sticky rice protein

2.2 碱性蛋白酶提取糯米蛋白的单因素分析

2.2.1 pH对糯米蛋白提取率的影响 按照1.2.2中酶法提取工艺流程进行实验，分别考察pH为8、9、10、11和12时的提取率，结果见图2。

图2 pH对糯米蛋白提取率的影响Fig.2 The effect of pH on extraction rate of sticky rice protein

由图2可以看出，在pH 8～10范围内，随着pH的升高，糯米蛋白的提取率升高，当pH为10时，达到峰值;随后再随pH升高，提取率反而下降，且样品液颜色变深。这一结果与碱性蛋白酶的最适pH范围相吻合［18］。

糯米蛋白质中含有较多的二硫键，碱液可以使糯米蛋白质紧密结构变得疏松，同时碱液对蛋白质分子的次级键特别是氢键具有破坏作用，并可使某些极性基团发生解离，使蛋白质分子表面的分子具有相同电荷，从而对蛋白质分子有增溶作用，这种增溶作用随碱性强度的增加而增大;但再度提高pH，会造成蛋白质过度水解，提取率降低，同时氨基酸间有可能发生缩合反应，生成赖氨酰丙氨酸等有害身体健康的物质［19］。从图2中看出，pH=9与pH=10的提取率相差不大，从保护蛋白质特性角度选择pH =9为最佳。

2.2.2 温度对糯米蛋白提取率的影响 按照1.2.2中酶法提取工艺流程进行实验，分别考察温度为25、35、45、55和65℃时的提取率。结果见图3。

由图3可以看出，碱性蛋白酶水解糯米蛋白的提取率随温度升高逐渐增大，但在温度达到45℃左右后，提取率不再增大，温度继续上升，提取率反而减小。这是由于一定范围内温度的升高，可以增加反应的活化分子数，反应速率增大。当达到最适温度后，继续升温，会导致酶及蛋白质的变性失活，提取率降低［20］。所以45℃是碱性蛋白酶的最适作用温度。

2.2.3 料液比对糯米蛋白提取率的影响 按照1.2.2中酶法提取工艺流程进行实验，分别考察料液比为1∶6、1∶8、1∶10、1∶12和1∶14时的提取率，结果见图4。

图3 温度对糯米蛋白提取率的影响Fig.3 The effect of temperature on extraction rate of sticky rice protein

图4 料液比对糯米蛋白提取率的影响Fig.4 The effect of solid to liquid ratio on extraction rate of sticky rice protein

由图4可知，随着料液比的增加，糯米蛋白的提取率开始变大，且上升速度比较快，在1∶6的料液比下，溶液的粘度较大。分子扩散速率低，导致体系分散不均匀，并且可能导致局部的pH过高，酶活性降低［21］。随着料液比的增大，碱性蛋白酶水解糯米蛋白的提取率逐渐增大，在料液比达到1∶10之后，趋于平缓，且略有下降，1∶10是糯米蛋白提取实验的最佳料液比。

2.2.4 加酶量对糯米蛋白提取率的影响 按照1.2.2中酶法提取工艺流程进行实验，分别考察加酶量(E/S)为1%、1.5%、2%、2.5%和3%时的提取率，结果见图5。

图5 酶用量对糯米蛋白提取率的影响Fig.5 The effect of enzyme dosage on extraction rate of sticky rice protein

从图5可以看出，糯米蛋白的提取率随加酶量的增加而增大，但当加酶量(E/S)超过2%之后，提取率趋于平稳。这是因为在底物浓度一定的情况下，反应速率与酶浓度成正比例关系［20］。当加酶量(E/S)为2%时，蛋白质的提取率最高。再提高加酶量时，蛋白质过度水解，提取率下降。所以选取加酶量(E/S)为2%。

2.2.5 反应时间对糯米蛋白提取率的影响 按照1.2.2中酶法提取工艺流程进行实验，分别考察时间为2、3、4、5和6h的提取率，结果见图6。

图6 时间对糯米蛋白提取率的影响Fig.6 The effect of time on extraction rate of sticky rice protein

由图6可见，随着反应时间的延长，碱性蛋白酶对糯米蛋白的提取率逐渐增大，但当时间大于3h后，提取率的变化趋势不明显，所以选取提取时间为3h。

2.3 碱性蛋白酶提取糯米蛋白最佳工艺的确定

在以上单因素的基础上，进行单因素方差分析，结果如表2所示，根据单因素的显著性选取了对糯米蛋白提取率的料液比、温度和加酶量显著的三个因素，按L9(33)进行正交实验，正交实验结果见表3。

表2 单因素方差分析Table 2 Single factor analysis of variance

表3 L9(33)正交实验结果及分析Table 3 Results of L9(33)orthogonal array design experiments and range analysis for SDF yield

根据正交实验结果，可知正交实验设定的三因素对提取率的影响大小次序为:A＞B＞C。碱性蛋白酶水解糯米蛋白的最佳反应条件为A2B3C2，即温度45℃、料液比1∶12、加酶量(E/S)2%，pH=9和水解时间3h。在此条件下进行验证实验，并重复三次。糯米蛋白平均提取率为8.529%。

2.4 糯米蛋白水解物抗氧化实验结果

2.4.1 糯米蛋白水解物清除DPPH自由基的效果分析 由图7可见，糯米蛋白水解物和VC均有清除DPPH自由基的能力。糯米蛋白水解物随着浓度的增大，清除DPPH自由基的能力呈增大的趋势，在糯米蛋白水解物浓度为1.0mg/mL时，其清除率约为60.00%。VC对DPPH的清除率虽然也随着浓度的增大而增大，但其增幅不大，清除率基本保持在7.00%左右。通过比较可得，糯米蛋白水解物比VC具有更强地清除DPPH的能力。

图7 糯米蛋白水解物和VC对DPPH自由基的清除能力Fig.7 Concentration dependence of scavenging rate of hydrolyzate from sticky rice protein and VCagainst DPPH free radicals

2.4.2 糯米蛋白水解物清除羟自由基的效果分析由图8可见，糯米蛋白水解物和VC均有清除羟自由基的能力。随着糯米蛋白水解物浓度的增大，其对羟自由基的清除能力呈增大的趋势，在0.2～1.0mg/mL的浓度下，其对羟自由基的清除率基本保持在35%～50%的范围内缓慢均匀增加。而VC在0.2～0.8mg/mL的条件下，随着浓度的增大，其对羟自由基的清除率增大，清除率最高达到 69.00%。当 VC浓度高于0.8mg/mL时，其对羟自由基的清除率反而下降。

图8 糯米蛋白水解物和VC对羟自由基的清除作用Fig.8 Concentration dependence of scavenging rate of hydrolyzate from sticky rice protein and VCagainst hydroxyl free radicals

2.4.3 糯米蛋白水解物的还原能力分析 在还原能力分析中，反应产物在700nm中的吸光值越大，表明样品的还原能力越大。从图9可见，糯米蛋白水解物和VC均表现出较强的还原能力。在糯米蛋白水解物和VC浓度为0.2～0.6mg/mL时，它们的还原能力基本保持不变;当浓度超过0.6mg/mL后，它们的还原能力显著增强。而且在相同浓度下，糯米蛋白水解物的还原能力比VC强。

图9 糯米蛋白水解物和VC的还原能力Fig.9 Concentration dependence of reducing power of hydrolyzate from sticky rice protein and VC

3 结论

通过四种蛋白酶和碱法提取糯米蛋白提取率的比较，得出碱性蛋白酶是提取糯米蛋白的最佳选择。通过单因素实验和正交实验结果分析得出，碱性蛋白酶提取糯米蛋白的最佳工艺条件为:料液比1∶12、加酶量(E/S)2%、温度45℃、pH=9、水解时间3h。在此条件下糯米蛋白提取率可达8.529%。抗氧化活性实验结果表明，糯米蛋白水解物具有一定的清除DPPH自由基和羟自由基的能力，且具有较强的还原能力，因此本研究得到的糯米蛋白水解物是一类天然的抗氧化氨基酸及其聚合物。

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Optimization of alkaline protease extraction of sticky rice protein from sticky rice and properties mensuration of hydrolysates of sticky rice protein

WANG Guo－ze1，YUAN Huai－bo2，*，XU Jian－wen2
(1.School of Mathematical Physics and Biology Engineering，Inner Mongolia University of Science and Technology，Baotou 014010，China; 2.School of Biotechnology and Food Engineering，Hefei University of Technology，Hefei 230009，China)

In order to obtain the extraction of sticky rice protein，sticky rice was used as raw materials by alkaline protease.The influence factors，amount of solid to liquid ratio，enzyme dosage，pH，temperature and time of the alkaline protease，which could affect the efficiency of extracting sticky rice protein，were investigated by singlefactor experiment and orthogonal test.The research results showed that the optimal technical parameters could be obtained as following:solid to liquid ratio 1∶12，enzyme dosage 2%，pH=9，temperature 45℃and time 3h.The max extraction rate of sticky rice protein reached to 8.529%.Antioxidant tests of protein hydrolysates by papain showed that hydrolyzate from sticky rice protein serves as amino acids or their polymer.

sticky rice protein;extraction;antioxidant

TS201.1

B

1002－0306(2012)08－0259－05

糯米蛋白是一种营养价值极高的蛋白质，主要由清蛋白、球蛋白、醇溶性蛋白和谷蛋白四种蛋白组成，它的氨基酸组成平衡合理，且含量较高，是被公认为优质的食品蛋白。糯米蛋白的生物价很高，其营养价值可与鱼、鸡蛋、牛乳、牛肉等相媲美［1－2］。此外，糯米蛋白是抵抗原蛋白，不会产生过敏反应，在生产婴幼儿食品方面有着广泛应用。糯米蛋白不仅具有独特的营养功能，同时还具有降低血清中胆固醇含量等保健功能［3－5］。目前提取蛋白的方法主要有物理提取、碱法提取和酶法提取。物理提取是通过破碎细胞结构而获取蛋白的方法，其提取率低，设备投资较高［6－7］。碱法提取简便易行，但在碱液浓度过高情况下，会影响产品风味和色泽，同时会产生不利反应，并会改变蛋白质的结构和营养特性［8－10］。酶法提取反应条件温和，不会产生有害物质，而且能更多保留蛋白质营养价值［11－13］。本文以糯米为原料，采用碱性蛋白酶水解法制备糯米蛋白，以糯米蛋白的提取率为评价指标，确定各因素的最佳提取条件，以提高糯米蛋白的产率，从而提高糯米的经济价值。

2011－07－06 *通讯联系人

王国泽(1975－)，女，教授，博士，主要从事农产品加工与贮藏方面的研究。

教育部春晖计划合作科研项目(Z2009－1－01039);内蒙古科技大学创新基金项目(2009NC060)。