不同潮水量下普洱茶渥堆过程中微生物及酶活变化研究

胡 捷，刘通讯

(华南理工大学轻工与食品学院，广东广州 510640)

不同潮水量下普洱茶渥堆过程中微生物及酶活变化研究

胡 捷，刘通讯*

(华南理工大学轻工与食品学院，广东广州 510640)

运用实验室规模模拟渥堆，研究不同潮水量(30%、35%、40%、45%)下普洱茶渥堆过程中微生物及酶活的变化。结果表明:渥堆过程中，初期霉菌大量生长，呈现优势菌种，后期堆温下降，酵母、细菌开始大量生长。35%潮水量下多酚氧化酶活性显著高于其它组，且堆温对多酚氧化酶活性影响不大，渥堆过程中微生物不分泌过氧化物酶。45%潮水量下蛋白酶活后期低于原料样，相比其他组显著偏低，说明潮水量过高、堆温降低会在一定程度上抑制蛋白酶酶活。淀粉酶酶活随潮水量增加显著增强，但潮水量40%与45%差异不明显。40%、45%潮水组茶胚果胶酶、纤维素酶酶活高于30%、35%。因此，选择合适的潮水量有利于普洱茶品质与功能的提高。

普洱茶，渥堆，潮水量，微生物，酶活

普洱茶是以云南大叶种晒青毛茶为原料，在特定的环境条件下，经微生物、酶和湿热等综合氧化作用，其内含物质发生一系列转化，从而形成独特品质特征［1］。渥堆发酵是形成普洱茶品质的关键工序，而普洱茶渥堆前的茶胚潮水增湿是渥堆前的关键技术［2］。在渥堆过程中，霉菌能充分利用渥堆茶中的各种多糖为碳源，进行糖代谢，产生单糖和双糖，从而促进了酵母菌和霉菌大量繁衍，抑制了细菌的生长。同时，渥堆过程的湿热作用又为微生物的活动和代谢创造了良好的环境条件，亦给茶叶内含物化学成份的变化提供了热源，从而加强了酶系的活动。微生物所分泌的酶对普洱茶内含物成份中的各类物质发生的物理化学变化产生极大的作用，使普洱茶香气由纯正的清香转变为浓厚醇香和独特的陈香，滋味由苦涩转变为醇和回甘，汤色由黄绿转变为黄红明亮，叶底由青绿转变为棕褐，从而形成了普洱茶醇厚、甘滑、活顺、陈香的品质特点［3－5］。本研究以云南大叶种晒青毛茶为原料，通过不同潮水处理进行渥堆，研究不同渥堆程度普洱茶中微生物(霉菌、酵母和细菌)、水解酶类(蛋白酶、纤维素酶、果胶酶和淀粉酶)和氧化酶类(多酚氧化酶和过氧化物酶)活性的变化规律，有利于进一步了解酶促氧化的作用机理，以期为微生物菌种、外源酶制剂的应用和普洱熟茶生产工艺技术提升提供参考和借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

晒青毛茶 云南腾冲，2011年。

ESJ200－4电子分析天平 上海精科电子有限公司;SpectrumLab22PC型分光光度计 上海棱光技术有限公司;富华420型三用水箱 金坛市富华仪器有限公司;LRH－250－S型恒温恒湿培养箱 广东省医疗器械厂;YX－280D手提式压力蒸汽灭菌锅 江阴滨江医疗设备有限公司;GL－21M高速冷冻离心机长沙湘仪离心机仪器有限公司;DHG90A电热恒温鼓风干燥箱 上海索普仪器有限公司。

1.2 实验设计

晒青毛茶，分别加水增湿至茶堆含水量30%、35%、40%、45%进行实验室模拟渥堆，重复三次，每堆用量4kg。35%与45%潮水发酵时间在2011年11月～2011年12月，30%与40%发酵时间为2011年12月～2012年1月。

取样:渥堆过程中，每6d进行翻堆，共翻堆四次，并在翻堆前取样。每次翻堆时分别在堆表、堆芯处采取五点取样法，取样50g，混合均匀后，即为堆表样和堆芯样。采样后立即进行水分含量测定，微生物测定和酶液制备(时间间隔不超过2h)。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 茶胚含水率和堆温的测定 茶胚含水率测定采用GB/T8304－2002，120℃烘干法。堆温:每天用水银温度计分别于8:00、14:00和22:00时测定茶胚堆芯温度，算出平均值。

1.3.2 微生物计数 霉菌、酵母总数测定:参照GB4789.15－2010，采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)。

细菌总数测定［6］:采用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。微生物计数单位为cfu/g(以干重计)。

1.3.3 酶活测定 多酚氧化酶酶活测定采用邻苯二酚比色法［7］。过氧化物酶酶活测定采用愈创木酚比色法［8］。蛋白酶酶活测定参考 SB/T10317－1999和文献［9］的方法。果胶酶、纤维素酶和淀粉酶酶活测定采用 3，5－二硝基水杨酸(DNS)比色法［10－13］。

1.4 数据分析

数据处理及做图采用Microsoft excel 2010进行，用SPSS19.0软件对数据进行方差分析和相关性分析。

2 结果与分析

2.1 不同潮水量下普洱茶渥堆过程中堆温变化

堆温是普洱茶发酵过程中主要的控制因子。通过翻堆一方面调节了渥堆茶叶的温度，同时也使堆内和堆表茶叶都能受到湿热和微生物作用。如此反复，形成了普洱茶特有的品质。从图1可知，晒青毛茶加水增湿后，堆温迅速升高，在一翻至三翻过程中，30%渥堆组因潮水量过低导致堆温不足，其余组堆温始终保持在30～40℃之间，有利于微生物生长繁殖和酶促反应。结合图1、图2可以看到，35%、45%渥堆组堆温比30%、40%组高(35、45%实验组渥堆时环境温度较30、40%组高)，说明外界环境会影响茶胚堆温，进而影响渥堆品质。

2.2 不同潮水量下普洱茶渥堆过程中微生物变化

图1 不同潮水量下普洱茶渥堆过程中堆温的变化Fig.1 Time courses of temperature of pile of tea leaves during the fermentation process for Pu－erh tea wetted with various water contents

图2 普洱茶渥堆过程中室内温度的变化Fig.2 Time courses of room temperature during the fermentation process for Pu－erh tea

原料晒青毛茶经加水增湿后，微生物开始大量生长。从表1可知，渥堆初期不同潮水量下茶胚中霉菌数量大量增长，主要以黑曲霉为主，随后数量趋于稳定，变化不明显，这与Abe［14］的结论一致。如表2所示，在茶胚渥堆期间，不同潮水量处理样本间霉菌总数变化不显著;茶胚堆表处霉菌受翻堆次数变化非常显著，一翻、二翻时达到最大，随后开始显著减少，三翻到四翻时变化不明显。而堆芯处霉菌受翻堆次数变化不明显。

霉菌能利用各种多糖作为碳源代谢产生大量的双糖和单糖，从而促进酵母菌迅速繁殖，成为渥堆后期优势菌种。茶胚渥堆期间酵母总数受翻堆次数影响非常显著，不同潮水量处理对茶胚堆表酵母总数达显著差异水平，对堆芯处变化不明显。40%潮水量下堆表处酵母相比其他组生长旺盛;堆表处酵母在二翻到三翻时显著增加，堆芯处三翻到四翻显著增加。从表3可知，在外界温度适宜的条件下，如35%、45%潮水组，酵母数量与堆温呈显著负相关，说明渥堆后期堆温下降也是酵母开始大量生长的原因之一。

细菌也是渥堆过程中重要的微生物类群之一，在渥堆中后期表现为优势菌。此结果与前人研究差异较大，周红杰等人发现，渥堆过程中曲霉始终处于优势地位，酵母菌次之，细菌数目极少［15］。不同潮水量和不同翻堆次数处理下细菌总数达非常显著差异水平。35%、40%潮水量下堆表处细菌总数变化无明显差异，但相比30%、45%组生长旺盛，40%潮水量下堆芯处细菌在渥堆后期相比其它组生长旺盛;堆表处细菌二翻到三翻显著增长，堆芯处二翻后显著增长。一方面由于初期霉菌大量繁殖，一定程度上抑制了细菌的生长，另一方面由于茶多酚对细菌具有广泛的抑制作用，并且茶多酚的抑菌能力与其浓度呈正效应关系［16］。而晒青毛茶中茶多酚含量较高，且在整个发酵过程中，总体上呈下降趋势，这也是发酵过程前期细菌数量较少，而后期有所增加的一个重要原因。

表1 不同潮水量下普洱茶在渥堆过程中微生物和酶活变化Table 1 Time courses of microbes and enzyme activities during pile－fermentation for Pu－erh tea wetted with various water contents

表2 潮水量和翻堆次数对各生化指标变化的显著性差异Table 2 Significant difference of water content and turning number on changes of biochemical characters

2.3 渥堆过程中氧化酶类活性变化规律

原料晒青毛茶的多酚氧化酶活性极低，仅(0.51±0.08)U/g(见表1)。潮水量对多酚氧化酶酶活的影响非常显著，35%潮水量下酶活显著高于其它组;翻堆次数对堆芯处酶活的影响非常显著，对堆表影响不明显。堆芯处酶活呈现先增加后减少的趋势，三翻时达到最大。实验中用愈创木酚法没能测出过氧化物酶酶活性，说明经高温杀青后的晒青毛茶原料没有过氧化物酶，而且渥堆过程中微生物也不分泌过氧化物酶。

2.4 渥堆过程中水解酶类活性变化规律

毛茶中蛋白酶和淀粉酶酶活分别为酶活(320±31)μg/(g·min)和(916 ±20)μg/(g·min)，说明在产生微生物前，这两种酶已经作为内源酶存在于茶叶中。潮水量和翻堆次数对蛋白酶及淀粉酶酶活的影响非常显著。渥堆过程中蛋白酶酶活在一翻时达到最大，如35%潮水量堆芯处达(1049±70)μg/(g·min)。随后开始显著减少，后期增强，呈“双峰”变化，说明渥堆期间茶胚微生物代谢种群可能发生变化;45%潮水量下蛋白酶活后期低于原料样，相比其他组显著偏低，说明潮水量过高会在一定程度上抑制酶活。茶胚淀粉酶酶活随潮水量增加显著增强，但潮水量40%与45%差异不明显;堆表处淀粉酶酶活随翻堆次数变化呈现先增大后减少的显著趋势，三翻时达到最大值，堆芯处随翻堆次数变化显著，后期变化不明显。

表3 不同潮水量下茶胚堆温与微生物菌群、酶活的相关系数Table 3 Correlation between temperature and microbes and enzyme activities with various water contents

表4 不同潮水量下茶胚微生物和酶活性的相关系数Table 4 Correlation between microbes and enzyme activities with various water contents

毛茶中果胶酶和纤维素酶酶活分别为(84±22)μg/(g·min)和(88 ±23)μg/(g·min)，经加水增湿后酶活变化非常明显。潮水量对堆芯果胶处酶活影响非常显著，对堆表影响不明显，其中潮水量40%堆芯处酶活相比35%显著增强，而30%与35%、40%与45%分别差异不明显;翻堆次数对果胶酶酶活影响非常显著，渥堆时二翻到三翻酶活显著增强，随后变化不明显，其中堆表处一翻到二翻差异不明显，堆芯处一翻到二翻显著减少。潮水量和翻堆次数对堆芯处纤维素酶酶活影响非常显著，对堆表影响不明显。堆芯处酶活在二翻到三翻时酶活显著增强;在潮水量40%、45%下酶活差异不明显，但活性显著高于30%、35%。

2.5 不同潮水量下茶胚堆温与微生物菌群、酶活的关系

普洱茶在渥堆过程中，由于微生物大量繁殖呼吸放热，导致堆温上升(图1)。而堆温上升又会进一步影响茶胚微生物繁殖以及酶促反应强度。但从表3中知，多酚氧化酶活性几乎不受堆温影响。在茶胚潮水量为45%时，堆温与霉菌、蛋白酶呈显著正相关，与酵母、细菌、淀粉酶、纤维素酶和果胶酶呈显著负相关。渥堆初期，堆温上升，霉菌生长，蛋白酶活性最强，到中后期堆温下降，酵母、细菌大量生长，淀粉酶、纤维素酶和果胶酶活性开始增强，从而形成45%组独特的普洱风味。

2.6 不同潮水量下茶胚酶活性变化与微生物的关系

霉菌中黑曲霉、酵母菌以及细菌是分泌胞外酶极为丰富的菌种，它不仅可以分泌纤维素酶、果胶酶、蛋白酶、脂肪酶和各种糖化酶等水解或裂解酶类，还可以释放多酚氧化酶等氧化酶类。渥堆中微生物种群的更迭及数量的消长，决定了整个体系中酶系的种类与活性水平。为了找出不同潮水量下每一种酶与微生物之间的内在联系，对渥堆过程中各种酶活性和微生物种群数量之间进行关联度分析，结果如表3所示。

从表4可知，渥堆中微生物分泌胞外酶受初始潮水量和通气效果影响。潮水量35%、40%下堆表处多酚氧化酶与酵母存在显著相关，而堆芯处则与霉菌显著相关;潮水量30%则与之相反，潮水量45%下堆表处与细菌存在一定关联，堆芯处与微生物消长近乎无关联。蛋白酶在45%潮水量下与霉菌显著相关，在40%潮水量堆表、30%堆芯处下两者也显著相关，而在35%潮水量堆表处蛋白酶则与酵母显著相关。潮水量40%、45%茶胚果胶酶、纤维素酶、淀粉酶与各类微生物均存在显著相关，而在潮水量偏低时不明显。与刘仲华结论基本一致，多酚氧化酶、纤维素酶和果胶酶活性与真菌类数量变化(主要是酵母菌和霉菌)存在显著相关;酸性蛋白酶仅与真菌类的黑曲霉有较强的关联度;而过氧化酶活性与细菌和真菌类微生物的消长近乎无相关性［5］。

3 结论与讨论

渥堆开始时茶胚潮水量的高低是影响微生物生长繁殖的重要因子，在很大程度上决定了微生物繁殖速度及菌群分布，进而影响到茶胚温度和pH变化，决定了普洱茶渥堆的效果。

普洱茶渥堆过程中微生物变化是极其复杂的，有的微生物自始至终对普洱茶品质形成发挥着积极的作用，有的微生物是在普洱茶加工的某一阶段发挥着形成普洱茶独特风格的作用，有的微生物则不利于普洱茶品质的形成。

普洱茶初制中，鲜叶经高温杀青后，固有的内源酶系统活性已基本钝化。然而在渥堆中微生物代谢所分泌的胞外酶形成新的酶系统，为茶叶中茶多酚的氧化、纤维素的分解、果胶质的裂解、蛋白质的降解提供了有效的生化动力，这些酶使茶的内含物发生了复杂的变化，影响普洱茶色、香、味品质形成。潮水量45%的茶胚在渥堆初期，堆温上升，霉菌大量生长，蛋白酶活性增强，到中后期堆温下降，酵母、细菌大量繁殖，淀粉酶、纤维素酶和果胶酶活性逐渐增强，从而形成45%组独特的普洱风味。

在普洱茶渥堆过程中，由于不同潮水量的茶坯堆温、含水量的差异，导致所着生微生物以及所释放胞外酶酶活强弱不一，进而影响普洱茶品质形成。因此，选择合适的潮水量有利于普洱茶品质与功能的提高。本实验通过小规模自然渥堆研究其微生物及酶活的变化，可以在此基础上，通过选择合适的微生物菌剂、外源酶制剂，进一步探讨对普洱茶品质的影响，为普洱茶发酵工艺的改进提供一定的理论依据。

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Study on change of microbes and enzyme activities of Pu－erh tea during pile－fermentation process with various water contents

HU Jie，LIU Tong－xun*
(College of Light and Food Science，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China)

The change ofmicrobes and enzyme activities was investigated during differentstages of pile－fermentation process of Pu－erh tea with various water contents(30%，35%，40%，45%)in laboratory－scale.During pile－fermentation process，mould was dominant strain growth in large number at the beginning，then yeast and bacteria increased later while pile temperature went down.PPO of 35%group had significantly higher enzyme activity than others，and pile temperature had little effect on PPO.There was no POD secreted by microorganisms during pile－fermentation process.Protease of 45%group in later phase of fermentation had lower enzyme activity than raw material，and was significantly lower than other groups.It indicated that protease could be inhibited by high water content and low temperature.Amylase activity was significantly enhanced with water content increased，but there was no significant difference between 40%and 45%groups.Pectinase and cellulase of 40%，45%group had higher enzyme activity than 30%，35% group.Therefore，proper water content will be benefit to the improvement of quality and functions of Pu－erh tea.

Pu－erh tea;pile－fermentation;water content;microbe;enzyme activity

TS272.5

A

1002－0306(2012)17－0093－05

2012－02－27 *通讯联系人

胡捷(1988－)，男，硕士研究生，研究方向:粮食油脂及植物蛋白工程。