妊娠晚期维生素C干预对大鼠先天性膈疝模型中胎肺的作用

蔡晶晶 陈永卫 张建敏*

(1.首都医科大学附属北京儿童医院麻醉科，北京 100045;2.首都医科大学附属北京儿童医院外科，北京 100045)

先天性膈疝(congenital diaphragmatic hernia，CDH)是由于膈肌发育缺损或发育不全，腹腔脏器经过这些缺损进入胸腔的一种疾病，不仅造成同侧肺脏发育不良，同时也引起对侧肺脏的发育和功能异常，活产患儿中发病率约为 1∶2 000－3 000［1］。对于一些出生后已存在严重肺脏发育不良的患儿，手术治疗仍很难存活。因此，有关研究人员希望拓宽该病的治疗方向，通过产前干预促进肺脏发育［2］，为临床治疗提供新的思路。

目前，这一新思路的研究还集中在动物实验阶段。此前已有一些研究［3］显示，先天性膈疝的肺脏发育不良与细胞内的氧化反应有关，因此本研究通过建立先天性膈疝模型，应用具有抗氧化性质的维生素C作为产前干预药物，研究其对胎鼠肺脏发育的影响。

1 材料与方法

1.1 实验对象

1)孕鼠:S－D雌鼠12只〔生产许可证号:SCXK(京)2005－0006，使用许可证号:SYXK(京)2005－0022〕，体质量250 g左右，初次妊娠，采用抽签法随机分为对照组(C)、维生素C组(W)膈疝组(N)及治疗组(T)。

2)胎鼠:正常孕期为22 d，孕21 d时相同麻醉方法下剖腹取出胎鼠(对照组29只，维生素C组26只，膈疝组32只，治疗组30只)。

3)肺脏标本:取出称质量后立即投入Bouin液中固定。

1.2 实验方法

1)体质量250 g左右的S－D雌鼠，夜间合笼交配，次日晨检查，以见到孕栓记为妊娠第0天。

2)妊娠9.5 d时，对照组及维生素C组予1 mL食用油灌胃;膈疝组及治疗组予100 mg除草醚(NITROFEN——2，4－二 氯 苯 基－P－硝 基 苯 醚，Sigma 公司);溶于1 mL食用油中灌胃。

3)妊娠16.5～20.5 d时，对照组及膈疝组每日腹腔注射1 mL 0.9%氯化钠注射液，连续5 d;维生素C组及治疗组每日腹腔注射1.5 mg维生素C(溶于1 mL 0.9%氯化钠注射液中)，连续5 d。

4)为避免同类相食，于孕21 d时水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉孕鼠，剖腹取出胎鼠，分别记录3组胎鼠的体质量，检查各组胎鼠的膈疝发生率、发生部位及膈肌缺损程度。将胎鼠的肺脏取出称质量。

5)取出肺脏标本在Bouin液中固定24 h，制备石蜡切片，免疫组织化学技术显示ki－67的表达。试剂盒购自中杉公司，烤片后脱蜡入水，灭活内源性过氧化物酶，抗原修复，标记一抗(经预实验确定抗体稀释浓度为1∶200)、二抗，DBS显色，苏木精复染，脱水透明，加拿大树胶封片。细胞核显棕黄色者为增生的阳性细胞。每组采用抽签法随机选取2张切片，每张切片计算机随机选取6个高倍(×40)视野记录图像并保存(LEICAQWin，LEICA Q5501W，显微镜 DM LB2)。双人双盲法计算每个视野的阳性细胞比例。

1.3 统计学方法

采用SPSS 11.5统计软件进行数据处理，计量数据用均数±标准差(±s)表示，行单因素方差分析及均数两两比较，计数数据用例数表示，行χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 膈疝发生率

对照组及维生素C组胎鼠中无膈疝发生;膈疝组与治疗组的膈疝发生率分别为53.13%和46.67%，两组差异无统计学意义，详见表1。

表1 膈疝发生情况Tab.1 Incidences of CDH (%)

2.2 胎鼠平均体质量

治疗组胎鼠平均体质量高于另3组，结果差异有统计学意义，另3组组间差异无统计学意义(表2)。

2.3 平均胎肺质量

维生素C组及治疗组的平均胎肺质量均高于对照组，对照组高于膈疝组，结果差异有统计学意义，详见表2。

表2 各组胎鼠平均体质量、肺脏质量及增生细胞比例Tab.2 Mean body weight，lung weight and percentage of proliferation cells of fetal rat for each group

2.4 增生细胞比例

膈疝组增生细胞比例低于另3组，结果差异存在统计学意义，3组组间差异无统计学意义，详见表2。

低倍视野(10×)下观察4组胎鼠肺脏组织形态，细胞核显棕黄色者为增生的阳性细胞(图1)。

高倍视野(40×)下计算各组增生细胞比例，结果膈疝组增生细胞比例低于另3组(图2)。

图1 免疫组织化学技术显示胎鼠肺组织ki-67的表达Fig.1 Immunohistochemical stain(Ki-67)of fetal lung(10×)

3 讨论

Nitrofen最初曾被用作除草剂，又称除草醚，在发现其有致膈疝畸形的作用后被淘汰。但这一发现却为膈疝的研究者们所利用，作为建立膈疝模型的药物。根据早期研究［4］，除草醚的致畸机制主要在于其化学结构与甲状腺素(T4)极为相似，因此推断除草醚可能是通过竞争T4受体，取代或部分取代母鼠和胎鼠T4的作用，从而导致肺脏等脏器发育不良。

虽然肺脏的发育不良与疝入脏器的机械压迫有关，但动物CDH模型研究［5］显示:某些与肺脏发育分化有关的蛋白因子、染色体以及基因的表达也出现异常。Beckman D L等［6］在研究中将暴露了除草醚但没有发生CDH的标本也统计在内，结果发现即使在没有CDH的情况下，肺功能也显著降低;贾炜等［7］对除草醚诱导的大鼠CDH模型进行了研究，结论是:无论是否发生了CDH，肺泡面积与对照组相比均显著减少，肺泡间隔也都显著增厚。由此提出，存在原发肺脏发育不良的可能。所以在本次实验中，将膈疝组及治疗组中未发生膈肌缺损的数据也一并统计在内进行了分析，无论是肺脏质量还是细胞增生方面，所得到的结果与发生膈疝组基本相同，支持了上述肺脏存在原发发育不良的观点。

现阶段膈疝产前诊断的主要方法为B超，欧洲的产前诊断率达 59%，平均诊断时间为 24.2 周［8－9］，国内的诊断时间基本在孕晚期——所以，本次实验将给药时间确定为孕晚期，希望对临床工作起到一定的帮助作用。

图2 免疫组织化学技术显示胎鼠肺组织ki-67的表达Fig.2 Immunohistochemical stain(Ki-67)of fetal lung(40×)

维生素C作为众所周知的抗氧化剂，具有获取方便、价格便宜等优势，因此，本次实验选取维生素C作为干预因素，实验结果是孕晚期维生素C的干预没有明显改变胎鼠先天性膈疝的发生率。由于正常膈关闭的时间是孕17 d，膈肌缺损及脏器疝入有可能在此前已经发生，而本次实验维生素C的干预时间为孕16.5～20.5 d，因此考虑给药时间较晚可能是影响维生素C作用的原因之一。由于此前相似方法的研究结论较少，可用来比较的结果有限，维生素C对于膈疝发生率及胎肺发育的作用究竟如何还有待今后更多大样本实验的证实。

［1］Bösenberg A T，Brown R A.Management of congenital diaphragmatic hernia［J］.Curr Opin Anaesthesiol，2008，21(3):323－331.

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［3］Kinane T B.Lung development and implications for hypoplasia found in congenital diaphragmatic hernia［J］.Am J Med Genet C Semin Med Genet，2007，145c(2):117－124.

［4］Yoshimura S，Masuzaki M K，Miura K，et al.Effect of epidermal growth factor on lung growth in experimental fetal pulmonary hypoplasia［J］.Early Hum Dev，2000，57(1):61－69.

［5］Muehlethaler V，Kunig A M，Seedorf G，et al.Impaired VEGF and nitric oxide signaling after nitrofen exposure in rat fetal lung explants［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2008，294(1):L110－L120.

［6］Beckman D L，Cummings J J，Katwa L C，et al.Can maternal vitamin C supplementation prevent lung hypoplasia in the nitrofen－induced rat model of congenital diaphragmatic hernia?［J］.Pediatr Res，2005，57(3):392－395.

［7］贾炜，余家康，邹焱，等.成纤维细胞生长因子－7在除草醚诱导的先天性膈疝大鼠模型胎肺中的表达［J］.中华小儿外科杂志，2006，27(10):541－544.

［8］Gallot D，Boda C，Ughetto S，et al.Prenatal detection and outcome of congenital diaphragmatic hernia:a French registry－based study［J］.Ultrasound Obstet Gynecol，2007，29(3):276－283.

［9］Daskalakis G，Anastasakis E，Souka A，et al.First trimester ultrasound diagnosis of congenital diaphragmatic hernia［J］.J Obstet Gynaecol Res，2007，33(6):870－872.