复色1号方对小鼠B16黑素瘤细胞增殖及酪氨酸酶活性的影响※

马玲玲 邓 燕 杨 柳* 张明明 刘利利



复色1号方对小鼠B16黑素瘤细胞增殖及酪氨酸酶活性的影响※

马玲玲 邓 燕 杨 柳* 张明明 刘利利

（南方医科大学中医药学院，广州 510515）

探讨复色1号方对小鼠B16黑素瘤细胞增殖及酪氨酸酶活性的影响。采用MTT法测定不同浓度的复色1号方对小鼠B16黑素瘤细胞增殖的影响，多巴速率氧化法测定对酪氨酸酶活性的影响，对其结果进行统计分析。复色1号方浓度在0.001～0.01g/l,范围内对小鼠B16黑素瘤细胞的增殖与对照组相比无统计学意义（＞0.05），0.05～0.1g/l浓度范围内对小鼠B16黑素瘤细胞的增殖与对照组相比有显著意义（＜0.05），呈现一定的抑制作用；复色1号方在0.001～0.1g/l浓度范围内对小鼠B16黑素瘤细胞中酪氨酸酶活性的影响与对照组相比，各浓度含药培养基组的A值均有显著性差异（＜0.05），呈剂量依赖性激活作用。在0.001～0.01g/l浓度范围内，复色1号方的最佳激活浓度为0.01g/l。复色1号方没有促进小鼠B16黑素瘤细胞增殖的作用；在一定浓度范围内（0.001～0.1g/l），对小鼠B16黑素瘤细胞酪氨酸酶的活性呈剂量依赖型激活作用。

复色1号方；小鼠B16黑素瘤细胞；酪氨酸酶

白癜风是常见的色素障碍性疾病。色素的多少决定了皮肤颜色，酪氨酸酶是黑素合成的关键酶，对其活性的调节可以直接影响黑素的合成。复色1号方是南方医科大学杨柳教授及其研究团队在多年对白癜风的研究基础上得出的经验外用方，用于进展期白癜风的治疗。临床实践表明，复色1号方在白癜风的治疗中有良好的效果。本研究观察了复色1号方水提取物对小鼠B16黑素瘤细胞增殖及酪氨酸酶活性的影响，为复色1号方治疗白癜风的作用机理探讨提供实验依据。结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验药物 复色1号方（组方：白蒺藜补骨脂紫草等，购于南方医院中药房）。

1.1.2 试剂 1640培养基（赛默飞世尔生物化学制品公司产品）；胎牛血清（杭州四季青公司）；MTT（四甲基偶氮唑蓝）、左旋多巴、二甲基亚砜（DMSO）、胰蛋白酶-EDTA（0.25%）、TritionX-100（美国Sigma公司）；其它试剂均为国产分析纯。

1.1.3 黑素瘤细胞株及来源 小鼠B16黑素瘤细胞株购于中国科学院上海细胞研究所。

1.1.4 主要仪器 倒置显微镜（Nikon公司），自动酶标仪（芬兰Thermo公司）等。

1.2 方法

1.2.1 中药水提取物制备 按复色1号方组方称取各药物（共180g），装入陶瓷药煲中，加适量蒸馏水浸泡30min，大火煎煮至水开后改小火煎煮40min，倒出药液；剩余药渣加适量水继续煎煮30min，倒出药液；合并2次药液，过滤后，浓缩至100ml，每100ml相当于原生药1.8g，经15000 r/min转速下离心10min后，0.22μm滤膜抽滤除菌，分装，保存备用。

1.2.2 细胞培养 小鼠B16黑素瘤细胞培养及传代参照文献[1]方法。

1.2.3 B16黑素瘤细胞增殖的测定[2]采用甲基偶氮唑蓝比色法（MTT法），具体步骤如下：取对数生长期细胞，常规消化，调节细胞浓度为0.5×104个/孔后加入96孔培养板，每孔100ul，置5% CO2恒温培养箱培养24h，再分别加入等体积的不同浓度复色1号方水提取物的培养基（浓度为0.001、0.005、0.010、0.050、0.100g/L），每一浓度设5个复孔，并设对照组，以不含药的培养液为对照组（细胞+培养基），不含细胞的培养液为空白对照组（培养基），各组培养基均含5%胎牛血清。5% CO2恒温培养箱中培养56h，于结束前加入MTT液（5mg/ml）20ul/孔，继续培养4h，去MTT液，加入DMSO 150ul/孔，震荡10min，置酶标仪于波长490nm处测各孔吸光度值A，以A表示细胞的增殖。计算细胞增值率，细胞增殖率=（A含药组-A空白组）/（A对照组-A空白组）×100%。

1.2.4 酪氨酸酶活性测定[3]采用多巴速率氧化法，对数生长期细胞，常规消化，调节细胞浓度为0.5×104个/孔后加入96孔培养板，每孔100ul。过夜贴壁后，根据MTT实验结果，加入等体积的0.001g/l、0.005g/l、0.1g/l浓度的受试液。以不含药的培养液为对照组（细胞+培养基），不含细胞的培养液为空白对照组（培养基），每组5个复孔。培养56h后弃培养基，用PBS洗涤2次，每孔加入1% TritonX-100溶液50μl，迅速置-80℃冻存30min，随后室温融化使细胞完全破裂，加入0. 5%左旋多巴20μl，37℃反应4h，酶标仪测定405nm吸光度值A，以A表示酪氨酸酶活性。酪氨酸酶活性率=（A含药组-A空白组）/（A对照组-A空白组）×100%。

2 结果

2.1 复色1号方水提取物对B16细胞增殖的影响 MTT实验结果显示，复色1号方浓度在0.001～0.01g/l对小鼠B16黑素瘤细胞增殖作用与单纯培养基对照组相比无显著意义（＞0.05），0.05～0.1g/l对小鼠B16黑素瘤细胞的增殖与对照组相比有显著意义（＜0.05），呈现一定的抑制作用，见表1。

表1 复色1号方对小鼠B16黑素瘤细胞增殖的影响 （±s）

注：与对照组相比，*表示＜0.05

2.2 复色1号方水提取物对酪氨酸酶活性的影响 在0.001～0.01g/l浓度范围内，与对照组相比，各浓度含药培养基组的A值均有显著性差异（＜0.05），复色1号方对小鼠B16黑素瘤细胞中酪氨酸酶活性呈剂量依赖性激活作用。在0.001～0.01g/l浓度范围内（＜0.05），复色1号方的最佳激活浓度为0.01g/l。见表2。

表2 复色1号方对小鼠B16黑素瘤细胞中酪氨酸酶活性的影响 （±s）

注：与对照组相比，*表示＜0.05

3 讨论

白癜风是由皮肤和毛囊的黑色素细胞内酪氨酸酶系统的功能减退或丧失而引起的常见色素脱失性疾病。因为有损美容，往往会给患者带来严重的心理负担和精神压力。白癜风的治疗历来都受到医学界的重视，然至今仍没有找到特效的治疗方法。南方医科大学杨柳教授及其领导的研究团队在多年的临床实践、理论和实验研究中，总结出一套中西医结合、内外治结合、分期论治的治疗方案。复色1号方即其中的一个成果，外用于进展期白癜风局部皮损。我们认为在白癜风进展期，多属风湿交杂、气血不和导致肌肤失养出现白斑[4-5]，故本方的组方原则为祛风除湿，调和气血。

对于白癜风的治疗机理，笔者总结目前有几个观点：①促进黑素细胞增殖；②增强酪氨酸酶活性，促进黑素的生成、运转；③抑制黑素细胞的破坏；④诱导刺激休止黑素细胞移行[6]；⑤调节黑素细胞内Ca2+紊乱等[7]。本研究将复色1号方水提取物直接作用于黑素瘤细胞，以观察其是否有通过促进黑素细胞增殖、增强酪氨酸酶活性这一机制以达到治疗白癜风的效果。

方中补骨脂、紫草等已有研究证实对黑素细胞增殖和酪氨酸酶活性有激活作用[8-9]。本研究显示，复色1号方在各药的联合作用下，在一定的范围内（0.001～0.01g/l）对小鼠B16黑素瘤细胞无增殖作用，在较高浓度（0.05～0.1g/l）对小鼠B16黑素留细胞的增殖呈抑制作用。研究过程中得出这个结果与我们预想的结果有些出入，我们预想复色1号方对黑素瘤细胞的增殖应呈促进作用。作者推想，本研究结果有可能是以下因素造成：①本实验用的是肿瘤细胞，且是小鼠的体外培养的黑素瘤细胞，与正常的黑素细胞有区别。有研究显示，本方中有些药物如补骨脂[10]、苦参[11]及紫草[12]含有抗癌的成分，故本实验中出现高浓度对小鼠B16黑素瘤细胞的抑制作用可能与此有关，但需进一步研究证实。②本实验直接将药液加入培养基中，不排除高浓度时药物浓度刺激关系对细胞的杀伤作用。

本研究结果显示，本方在一定浓度范围内（0.001～0.1g/l），对酪氨酸酶的活性呈剂量依赖型激活作用。表明本方可通过激活酪氨酸酶的活性进而促进色素的生成，进而有效治疗白癜风。

本研究只进行了复色1号方对小鼠B16黑素瘤细胞的影响，并未涉及其对人正常黑素细胞的作用、对黑素细胞周边细胞的作用、对有关色素代谢的细胞因子等的作用及其在动物或人体内的作用情况等问题，故本方对白癜风的治疗是否存在其他作用机制，仍需进一步的研究。

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（本文校对：王治华 收稿日期：2012-01-05）

Effects of Fuse Formula-1 on Cell Proliferation and Tyrosinase Activity of Cultured B16 Melanoma Cells

Ma Lingling Deng Yan Yang Liu Zhang Mingming Liu Lili

(The TCM College of Southern Medical University, Guangzhou 510515, China)

To study the effects of Fuse Formula-1 on cell proliferation and tyrosinase activity of cultured B16 melanoma cells.MTT method, DOPA-rate limiting method were employed to measure the cell viability and tyrosinase activity of B16 melanoma cells. And divided into experimental group (Fuse Formula-1), control group(bland control group), compared their results.Fuse Formula-1 concentration of 0.001～0.01g/l g /L for B16 melanoma cells had no effect (＞0.05), 0.05～0.1g/lg /L of Fuse Formula-1 on B16 melanoma cells for inhibition (＜0.05); 0.001-0.1g/l Fuse Formula-1for B16 melanoma cells, tyrosinase activity was in a dose-dependent activation.Fuse Formula-1 had no effect on cell proliferation of B16 melanoma cells, but exhibits a dose-dependent enhancing effects on tyrosinase activity in B16 melanoma cells.

Fuse Formula-1; B16 melanoma cells; proliferation; melanogenesis.

10.3969/j.issn.1672-2779.2012.06.100

1672-2779（2012）-06-0052-03

广东省“211工程”三期重点学科建设项目[No：粤发改社（2009）431号]