SSR分子标记技术在玉米杂种优势群划分中的应用

骈跃斌 ，许 晶 ，武岩军 ，王 华 ，古晓红

（1.山西省农业科学院食用菌研究所，山西太原030031；2.山西省农业科学院作物科学研究所，山西太原030032）

玉米种质资源是人类宝贵的物质财富，大量的种质资源是开展玉米育种的基础[1-2]。杂种优势是玉米品种选育的基础理论依据，杂种优势群及杂种优势模式的概念已为玉米工作者普遍接受。自20世纪80年代以来，育种家们通过对不同时期杂交种中主要亲本所占比例的估算，对我国的玉米种质基础进行了探索，通过种质系谱或地理来源分析，对生产上利用的自交系初步进行了类群划分，分子标记技术的发展为评价玉米种质基础提供了新手段[3-6]。

玉米自交系杂种优势群的划分与建立，是近年来国内外玉米育种家们研究的热点。这一研究有利于拓宽种质资源和克服种质资源的脆弱性，尤其对克服杂交组合组配的盲目性和提高育种效率至关重要[7-8]。

SSR标记亦称微卫星，是指由2～6个碱基组成的基本序列串联重复组成的短片段，是建立在PCR反应基础上的一种新型遗传标记。研究表明，SSR标记可有效地应用于玉米种质的遗传变异研究及类群划分[9-12]。李新海等[13]将SSR标记技术应用于我国玉米自交系的遗传变异研究，袁力行等[14]用66对SSR引物将29份玉米自交系划分为5个类群。

本研究采用SSR分子标记技术对32份玉米自交系的遗传多样性进行分析，并进行杂种优势群的划分，旨在为玉米分子标记辅助育种提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

32份玉米自交系材料（表1），均来自山西省农业科学院食用菌研究所。

表1 32份供试玉米自交系

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 采用CTAB提取法对DNA进行提取。（1）采用沙培法，将自交系材料置于30℃培养箱中培养7～10 d，待其长至两叶一心时，剪其新鲜黄化苗3 cm，分别装入2 mL离心管中，于液氮中迅速研磨成粉末；（2）加入CTAB提取缓冲液，65℃保温30 min；（3）取出离心管，冷却片刻，加入等体积的氯仿/异戊醇（24∶1），摇床振荡10 min；（4）在室温下10 000 r/min离心10 min，取上清液并加入等体积的氯仿/异戊醇（24∶1），摇床振荡 10 min；（5）在室温下10 000 r/min离心10 min，取上清液并加入0.8倍体积的异丙醇，小心摇匀至有白色沉淀出现；（6）4 ℃下 10 000 r/min 离心 5 min，弃上清液；（7）加入75%乙醇洗涤2次，离心后倒去乙醇，风干DNA；（8）加入 R40，4 ℃保存备用。

1.2.2 DNA浓度的测定及模板的制备 每管吸取提取的DNA 2 μL，用ddH2O稀释至200 μL，在蛋白质核酸定量测定仪上分别测定其浓度和纯度，然后根据测定的浓度值配制成0.02 μg/μL的工作液。

1.2.3 SSR反应体系 15 μL反应体系包括：5 μLDNA 模板，0.2 μLTaq 聚合酶，10×Buffer，（0.75＋0.75）μLSSR 引物，6.4 μLddH2O。

1.2.4 SSR反应程序 PCR反应在PTC-100PCR仪上进行。反应程序为：95℃预变性2 min，94℃变性 1 min，55 ℃退火 40 s，72 ℃延伸 1 min，共35个循环；最后在72℃延伸5 min。

1.2.5 电泳 在扩增产物中分别加入8 μL变性缓冲液，95℃变性7 min后，在6%聚丙烯酰胺变性胶上电泳。预电泳1 500 V 30 min，电泳1 500 V1 h。

1.2.6 染色 脱色与固定：电泳后，将胶板放入10%的冰乙酸固定液中，摇床摇20 min，直至指示剂蓝色褪去。漂洗：将胶板从固定液中取出，沥干，用双蒸水洗2次，彻底去除残余的固定液。染色：将冲洗后的胶板放入银染液中，轻摇30 min。过水：将银染过的胶板取出，沥干，用双蒸水快速充分过水10 s，去除银染液。显影：将胶板放入显影液中，先用手摇几下，然后再在摇床上摇荡，直至DNA条带现出为止。定影：将胶板从显影液中取出，沥干，放入固定液中5 min。然后用大量的水冲洗胶板，除掉残留的显影液，待晾干后进行扫描。

1.2.7 数据统计分析 SSR产物银染结果，有带记为“1”，无带记为“0”，建立数据库。利用NTSYS-peversion 2.1软件对数据进行处理，按UPGMA方法对供试自交系进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 24对SSR引物对32份玉米自交系的检测结果

以4个标准自交系、28份自选自交系为材料，进行SSR标记分析，从40对SSR引物中筛选出24对扩增产物具有稳定多态性的引物，且24对引物在玉米10条染色体上均有分布。

从表2可看出，在供试材料中共检出165个等位基因变异，每对引物检测到等位基因3～12个，平均为6.875个。

2.2 32份玉米自交系的聚类分析

用SSR标记遗传相似系数为原始数据，利用NTSYS-peversion 2.1软件进行数据处理，按UPGMA方法对供试玉米自交系进行聚类分析（图1），根据得出的遗传距离、相似系数可以将32份自交系分为4个类群：自交系莫17，Q625，Q835，Q601，Q741，Q801，3412 为第 1 大类群，该类群中含有标准测验种莫17，应属于Lancaster群；自交系丹 340，Q643，Q708，001A，9248 为第2大类群，该类群中含有标准测验种丹340，应属于旅大红骨群；自交系黄早4，Q1261，113，918，P536，9249，Q639为第3大类群，该类群中含有标准测验种黄早4，应属于塘四平头群；自交系478，K002，A1，Q710，112，Q622，100G，919，Q619，P401，Q702，强 B，111 为第 4 大类群，该类群中含有标准测验种478，应属于Reid群。

表2 24对SSR引物在32份玉米自交系中检测到的等位基因数

3 结论与讨论

试验中所用标记的数目及在染色体上的覆盖程度决定了遗传多样性分析的可靠性。本试验在供试材料中共检测出165个等位基因变异，每对引物检测到等位基因3～12个，平均为6.875个。32份玉米自交系的遗传距离变幅为0.77～0.95，遗传距离变幅较大，平均遗传距离也较大，表明供试自交系的亲缘关系较远。

SSR聚类结果与自交系已知系谱关系具有较好的一致性。从杂种优势利用的实践来看，强盛 16号（Q835×Q639）、强盛 11号（Q625×Q643）、强盛 62号（3412×9248）、晋单 56号（Q801×Q625）等多个已在生产上大面积推广的杂交种，其双亲均属于不同的类群，而在同一类群内几乎没有组配出高产杂交种。这充分说明了聚类结果的合理性，SSR分子标记是进行杂种优势群划分的有效分子标记。

对亲缘关系不清的自交系划分杂种优势群，可避免盲目性，有目的地选配杂交组合，从总体上提高育种水平。

在今后的研究中，如果将我国主要杂种优势群的标准检测种加入，选择少数与杂种优势QTL紧密连锁的、多态性好的引物，再辅以多年多点杂交组合的田间鉴定，将会更加经济有效、客观合理地对玉米种质的杂种优势群进行有效的划分。

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