金薄香核桃茎段初代培养的影响因素

牛 青，田建保，王国平

（1.山西大学生物工程学院，山西太原030006；2.山西省农业科学院，山西太原030006；3.山西省农业科学院果树研究所，山西太谷030815）

核桃（Juglans regia L.）属胡桃科胡桃属，是世界四大干果之一，有很高的经济、生态和社会效益以及潜在的营养、保健和医疗价值，在世界各地广泛栽培[1]。当前，在农业产业结构调整和加入世贸组织的新形势下，种植和发展核桃生产具有重要意义[2]。但作为异花授粉的果树，核桃实生繁殖常易丧失优良品种的特性，扦插又难以生根，嫁接繁殖也因接口处易发生褐变而成活率较低[3]。

组织培养以其快速繁殖苗木不受季节、时间、穗条数量限制和病虫害的影响，以及可周年生产试管苗的显著特点，被广泛应用于各种花草、果树苗木的培育[4]。同时，从遗传角度讲，利用组培技术还可得到高度一致、具有良好表现型的群体。

因此，20世纪60年代末，组织培养技术就已应用于核桃的快速繁殖。国外主要有奇异核桃、北加州黑核桃、东部黑核桃及普通核桃的成年树种组培快繁的报道[5]；而国内侧重于普通核桃组织培养的报道较多，如核桃组培离体繁殖技术在取材方面、控制外植体褐化、培养基组成及生根方面都有了很大进展[6]，尤其是针对核桃的茎段、芽、叶片、胚、子叶等作为外植体都有培养成功的报道[7-9]。近年来，国外利用组织培养技术已开始进行核桃优良品种商业化生产。

金薄香核桃是山西省农业科学院果树研究所经过近20 a的实生选育从新疆核桃中选育出的核桃优良新品种。该品种具有早实、壳薄、出仁率高、取仁易、品质优、丰产、抗逆性强等优良特性[10]。

本试验以金薄香核桃为试验材料，利用组织培养技术进行核桃茎段的快速繁殖，筛选出适合该品种组织培养的初代培养的最佳时间、最佳培养基及生长调节物质浓度的最佳配比，旨在为以后金薄香核桃的继代培养及生根培养提供理论支持。

1 材料和方法

1.1 试验材料

金薄香核桃茎段初代培养所取外植体材料为金薄香核桃母株的枝条。试验在山西省农业科学院果树研究所进行。

1.2 外植体材料的处理

将当年生核桃枝条的叶片去掉，仅留0.5 cm的叶柄，保湿带回实验室。先用洗洁精清洗1遍，然后用肥皂水清洗，再用自来水冲洗干净。用解剖刀将枝条截成单芽茎段，放在无菌水中。在超净工作台上用无菌水冲洗2次后，将茎段置于75%乙醇中浸泡30 s，再用0.1%HgCl2消毒7～10 min，最后用无菌水冲洗4～5遍，用滤纸将表面水液吸干，切去茎段的两头部分，接种到培养基中[7]。

1.3 培养基的制作

试验采用的基本培养基分别为MS，DKW，WPM，同时附加不同种类和浓度的生长调节物质，制成所需的培养基。各培养基均加入6 g/L琼脂粉，用1 mol/L的NaOH或1 mol/L的HCl调pH值至5.8～6.0。所有配好的培养基经高压蒸汽灭菌18～20 min（120～125℃，1.2个标准大气压）。抗生素经过滤灭菌，再加入经高温灭菌的培养基中。

1.4 金薄香核桃茎段初培最佳时间的选择

在金薄香核桃生长的季节（5月4日至9月12日），取当年生茎段为外植体，每月取材1次，1月20日取经过低温处理的休眠枝条为外植体，共6个处理，每个处理3次重复。每处理接种外植体50瓶，接种方式为竖直插入，每瓶1个茎段，培养基为MS＋6-BA2.0 mg/L＋IBA0.3 mg/L。接种3周后，统计污染率、褐化率、萌发率。

1.5 金薄香核桃茎段初培最佳培养基选择试验

试验采用L9（34）正交试验设计，试验因素及水平排列为：A.基本培养基为 MS（A1），DKW（A2），WPM（A3）；B.6-BA 质量浓度为 0.5（B1），1.0（B2），2.0（B3）mg/L；C.IBA 质量浓度为 0.1（C1），0.3（C2），0.5（C3）mg/L；D.庶糖质量浓度为20（D1），30（D2），40（D3）g/L。共 9 个处理，每处理接种30瓶，每瓶1个茎段，重复2次。初代培养约20 d左右调查萌发率。

在培养过程中，培养条件为（26±2）℃，空气相对湿度75%左右，光周期14 h/d，日光灯作为光源，光照强度2 000～3 500 lx。

2 结果与分析

2.1 金薄香核桃茎段初培最佳时间的选择

对采自不同时期的外植体茎段进行试验。从表1可以看出，不同生长季节的外植体茎段对初培的污染率、褐化率和萌发率有明显的影响。造成污染的主要原因是霉菌污染和内生菌污染。污染率随着取材时间的推移而升高，主要是由内生菌污染率的明显提高造成的。而休眠枝的污染率明显降低的原因是新抽生的枝条和5，6月份的枝条一样，枝条内部的内生菌数量很少。褐化率在生长季节没有明显的区别。萌发率为5，6月份较高，分别为86.4%和85.1%，且随着时间的推移，萌发率逐渐降低。而休眠枝的萌发率相对较高，这是因为休眠枝的污染率较低的缘故。因此，生长季节核桃茎段的初代培养以5，6月份最好；经过冬季低温处理的休眠枝的初培效果也不错，只是枝条要经过低温处理并水培萌发，程序多，较麻烦。所以，生长季节的5，6月份做核桃的初代培养最好。

表1 不同取材时间对金薄香核桃初培中污染率、褐化率、萌发率影响的多重比较

2.2 金薄香核桃茎段初培最佳培养基选择

由表2可知，最优的组合是A3B3C2D2，即在WPM培养基中，添加6-BA2.0mg/L，IBA0.3 mg/L，蔗糖30 g/L，但这并没有在本试验中反映出来；而从实际来看，最佳组合为处理2，即在MS培养基中，添加 6-BA 1.0 mg/L，IBA 0.3 mg/L，蔗糖30 g/L。因此，在进一步的试验中，可以验证这2个培养基的优劣。极差值越大，表示该因素越重要。表2显示，4个因素中，IBA的极差最大，表明最重要的是IBA，其次依次是6-BA、基本培养基和蔗糖。

从表3可以看出，初代培养最佳培养基的最优组合是处理2，且它与其他组合相比，有显著性差异。

表2 核桃初代培养最佳培养基选择

表3 核桃初代培养最佳培养基的多重比较

3 讨论和结论

在核桃的初代培养中，外植体的取材时间是初代培养成功的关键。因为核桃是多年生木本植物，核桃枝条暴露在田间，菌类滋生，还有的细菌甚至渗透到组织内部，因此，试验中外植体即使经过细致的表面灭菌，仍然有污染情况出现。同时，外植体的褐变是初培失败的主要原因。而外植体取材时间的不同，外植体的污染率和褐化率变化很大。本试验结果表明，外植体取材最佳时间是5—6月，此时污染率、褐化率相对较低，而萌发率有大幅度的提高。主要原因是此时采集的外植体材料生活力强，对外源激素敏感，反应强，分化能力也较强。同时，初代培养基的选择、外源生长调节剂的添加等也是促使外植体芽体萌发的主要影响因子。正交试验结果表明，在MS培养基中，添加 6-BA 1.0 mg/L，IBA 0.3 mg/L，蔗糖30 g/L，外植体萌芽效果最好。

[1]王娟，田建保，贺小红，等.“金薄香”核桃组培中灭菌及防止褐变的研究[J].山西农业大学学报，2008，28（3）：290-292.

[2]霍晓兰，刘和，冀爱青.植物生长调节剂在核桃上的应用[J].山西农业科学，2003，31（1）：34-39.

[3]王琴.核桃试管微繁增殖培养基的筛选 [J].甘肃林业科技，2003，28（4）：16.

[4]王国平，李晓梅.核桃无根试管苗微枝嫁接技术[J].山西果树，2006（1）：28-29.

[5]Driver J，Kuniyuki A.In vitro propagation of Paradox walnut rootstock[J].Hort Science，1984，19：507-509.

[6]刘淑兰，韩碧文.核桃愈伤组织的诱导[J].植物生理学通讯，1984（4）：38.

[7]张进，张燕，吴国良，等.核桃茎段组织培养[J].经济林研究，2005，23（2）：36-38.

[8]曹孜义.实生植物组织培养技术教案[M].兰州：甘肃科学技术出版社，1999.

[9]裴东，袁丽釵，谷瑞升.核桃子叶不定根发生调控的研究[J].林业科学，2003，39（6）：33-40.

[10]田建保，陈秋芳，程恩明，等.核桃新品种：金薄香1号[J].山西果树，2005（2）：3.