神经元的发育过程中p75NTR 和sortilinr的表达研究

李晓婷 王友翠 夏冠男 王廷华 齐建国

（四川大学 华西基础医学与法医学院，成都 610041）

神经元是神经系统的基本结构和功能单位，其高度分化，形态多样，结构复杂，在生理功能上具有接受刺激、传导冲动和整合信息的能力。脑功能的运行需要神经元通过这一复杂的神经网络进行信息传递。突触是实现这一传递的特殊结构。在神经元发育过程中，细胞的生存、生长、迁移、与其他细胞建立功能性联系，以及神经再生过程中轴突的生长等，除了受内源性程序的调控，还受到局部环境因素的影响，例如神经营养因子的维持和促生长功能。

proBDNF是脑源性神经营养因子BDNF 的前体，传统的观点认为这些神经营养因子前体是无活性的，但是2001 年，Lee等科学家首次发现神经营养因子前体可以促进细胞凋亡［10］。此后的研究发现，proBDNF的促细胞凋亡作用是由p75NTR 介导的。此外，Henry K Teng 等［11］发 现，proBDNF 能 够促进体外培养的表达p75和sortilin的神经元凋亡。

P75NTR（p75neurotrophin receptor），为一种Ⅳ型膜蛋白，分子量75kD，是神经营养因子的低亲和力受体，属于肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族成员。Sortilin，相对分子量95kD，是一种Ⅰ型跨膜糖蛋白，为已知的第一个不属于G－蛋白偶联受体超家族的跨膜神经肽受体，在体内广泛分布。但是其在体内的作用既不是合成肽类，也不是反应肽类。因此，我们建立体外神经元发育的模型，研究其生长发育过程中p75、sortilin的表达变化。为今后进一步研究proBDNF对神经元发育的影响奠定基础。

1 材料与方法

1.1 动物

采用新生0～1h的SD 大鼠，由四川大学实验动物中心提供。

1.2 主要试剂及其配

DMEM／F12（1∶1，Gibco）；B27（Gibco），胎牛血清（Hyclone），多聚赖氨酸（Invitrogen），青链霉素混合液，谷氨酰胺，胰酶等单克隆p75（MC192），sortilin抗体由澳大利亚周新福教授馈赠；tau－1 抗体购自，特异性识别轴突；Neun抗体，神经元的特异性抗体。10%培养基：DMEM／F12 88ml，双抗（青、链霉素）各1ml，FBS 10 ml，－20℃储存。无血清培养基：neurobasal 97ml，双抗（青、链霉素）各1ml，B27 2 ml，－20℃储 存。多聚赖氨酸：Poly－D－Lysine（PDL），浓度为1mg／ml，工作液浓度为0.1mg／ml。

1.3 新生大鼠海马神经元的体外培养

提前一天做好准备工作，取新生0～1h 的SD大鼠，浸泡75%酒精30s～1min消毒，断头（以上操作在细胞培养间进行）。将鼠脑置于高温消毒后盛有预冷D－Hanks液的培养皿中，放进超净工作台。左手用眼科镊夹住两眼睛处固定脑袋，右手用眼科剪分层依次剪开皮肤、颅骨，从人字缝及矢状缝将头皮和颅软骨组织分开，暴露出两侧大脑半球、嗅球及小脑。镊子与脑干垂直、右手取出两大脑半球，用冷的D－Hanks液将残留血液冲洗干净，置于另一装有预冷D－Hanks液的培养皿中，放于解剖显微镜下。用显微镊轻轻剔除脑膜，小心分开皮层，暴露并取出双侧海马组织，在D－Hanks液中漂洗后放入15ml离心管或1.5ml EP 管中，加入孵育好的10%FBS＋DMEM／F12培养基，一个大脑3ml，吹打10～20次制成细胞悬液，静置于试管架上3～5min，使较大组织块沉淀下来。取上层悬液，进行计数后按照实验要求以1×105／mL 密度接种于包被好的培养板或玻片上。将培养板置于37℃，5%CO2恒温培养箱培养，24h 后全量换液。以后根据细胞的生长情况及实验要求，每3d半量或全量换液，同时在倒置显微镜下观察细胞的形态和生长情况。换液时注意要提前把培养基放进培养箱孵育然后再进行换液。

1.4 神经元鉴定

培养3d时细胞已具有一定的形态，因此本实验选取3d的细胞进行鉴定，采用neun细胞免疫组织化学法。Neun阳性染色位于神经元的胞浆内，多为棕色或棕红色。

倒置相差显微镜下观察、拍照、计数。本实验中，所有着色细胞，代表细胞总数。根据公式计算出神经元纯度：［neun 阳性细胞数／着色细胞数（总细胞数）］×100%＝神经元阳性率（即神经元纯度）。

1.5 神经元发育过程中p75和sortilin的表达

根据实验要求选取不同时间点、不同条件的细胞取至试验台，吸去培养基，用预热的0.01 M PBS漂洗两次（不要把PBS 直接加到细胞上，也不要使细胞干掉）；然后用4%多聚甲醛固定30 min（多甲在37℃预热后再用，防止温度差异导致细胞脱落）；0.01M PBS充分漂洗；按二步法分别行免疫细胞化学染色。

2 结果

2.1 体外培养海马神经元的生长情况

普通倒置光学显微镜下观察，接种0h，大多数细胞呈圆球型悬浮于培养基中，折光性较好，单个散在分布。接种12～24h贴壁后，神经元周围长出类似于伪足的包裹体，边界不整齐；培养3d，包裹体周围开始有一些向外生长的突起，其中一个突起较其它突起迅速生长延伸，发育成较长的轴突，其余几个短小的突起则形成树突，神经元之间逐渐形成网络；培养7d，轴突继续延伸，树突分支增多，神经元轴突和树突相互交叉、连接，形成复杂的网络。

2.2 neun免疫组化染色鉴定，经计算阳性率可达到90%以上。Neun 阳性染色位于神经元的胞浆内，多为棕色或棕红色。根据公式计算出神经元纯度：［neun阳性细胞数／着色细胞数（总细胞数）］×100%＝神经元阳性率（即神经元纯度）。

2.3 细胞免疫组化

经细胞免疫组织化学染色发现，p75NTR、sortilin在神经元发育过程中均有表达。

3 讨论

神经元的体外培养一直是神经科学领域研究的重要技术。海马做为边缘系统的重要结构，具有高度序化的板层结构和神经元高度集中并相对独立的特点，而且在学习、记忆、认知、情绪反应以及神经系统疾病病理生理变化有情方面具有重要的作用，因此本次实验选取体外培养海马神经元作为模型。

目前国内外对于海马神经元的体外培养，传统方法多选用胎鼠进行取材。但由于胎鼠的胎龄不容易掌握，某些核团及功能区的解剖位置不易准确定位，因此选择新生鼠来代替胎鼠进行海马神经元体外培养的取材。且近年来选择新生鼠进行神经元原代培养的实验日渐增多［8］。

新生鼠与胎鼠相比，神经元分化程度高，神经突起发育成熟，神经元之间以及与纤维组织之间的连接比较紧密。而且有研究表明，通过投射电镜观察出生1d的新生大鼠海马，偶见神经元突触，且结构发育不完全、突触连接部位很短、突触小泡极少［7］。因此为提高神经元的纯度以及存活率，我们参照原有的，比较权威的培养方法［4］，取出生0～1h的SD大鼠海马组织，在解剖显微镜下剔除脑膜，精确定位取材，以保证组织的纯度。经机械吹打10～20次，使组织分散成单细胞悬液。以1×105／mL 密度种植于含10% 胎牛血清的DMEM／F12培养基中，24 h后全量换液。培养3d后，经neun鉴定，神经元的纯度可以达到80%以上。

［1］Zhou Xin－fu，Song Xing yun，Zhong Jin－hua，et al.Distribution and localization of pro－brainderived neurotrophic factorlike immunoreactivity in the peripheral and central nervous system of the adult rat［J］.Neurochem，2004，91：704－715.

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［7］刘宇，邓宇斌，周丽华.P75NTR 介导神经细胞凋亡研究进展［J］.生命科学，2007，1（19）：63－67.

［8］王圆圆，张文斌，陈静，等.大鼠海马神经元neurobasal无血清的原代培养方法［J］.2008，29（6）：547－551.

［9］周明，聂菁，吕诚，等.一种大鼠海马神经元的原代培养方法［J］.2010，50（3）：1－3.

［10］Lee R，Kermani P，Teng KK.Regulation of cell survival by secreted proneurotrophins.J Sci，2001；194：1945－1948.

［11］Teng HK，Teng KK，Lee FS，et al.ProBDNF induces neuronal apoptosis via activation of a reeptor complex of p75NTR and sortilin.J Neurosci，2005；25：5455－5463.