视网膜光化学损伤机制的研究进展

郭 星 综述 梅 妍 审校

（昆明医科大学，云南省第一人民医院眼科，昆明 650032）

视网膜光损伤的概念早在柏拉图时代就提出，直到1966 年Noell等才开始实验室研究［1］。近年来，随着眼科光学诊疗器械和显微手术应用的增多，各种器械光源所致视网膜损伤等问题越来越引起人们的重视。临床上一些常见的视网膜变性疾病如年龄相关性黄斑变性（ARMD）、视网膜色素变性（RP）等与视网膜光损伤有相似的病理过程，因此视网膜光损伤及其损伤防御机制的研究是近年眼科领域的一个重要研究课题。

视网膜光损伤的表现主要累及视网膜的光感受器细胞和色素上皮细胞。据文献报道［2－4］，光照后6h就已经出现眼内外节结构紊乱及淡染区，随后由于光感受器细胞的坏死而导致外核层、色素上皮细胞层细胞数减少，厚度变薄。光照后7d，由于坏死细胞大部分被吸收，外核层损伤加重，表现为细胞排列紊乱，部分消失及空泡出现，核层进一步变薄，仅留3～5层。

Wenzel等实验证明高强度的光照可引起视网膜光感受器细胞的凋亡，加快年龄相关性黄斑变性、遗传性视网膜色素变性等相关疾病的进展［5］。Gavrieli等采用TUNEL技术可特异性在细胞水平原位显示凋亡细胞断裂的DNA 链，从而可在光镜下识别凋亡细胞［6］。研究者通过对光照后视网膜细胞DNA 的抽取，凝胶电泳后，发现存在180bp的DNA片段，说明光损伤时启动了视网膜细胞的凋亡［7］。近年国内外许多学者进行了大量的研究，但关于视网膜光损伤的机制尚不十分清楚。比较一致的观点是：视网膜光损伤有三种类型，即热损伤、机械损伤和光化学损伤［8－9］，其中光化学损伤是视网膜光损伤中最主要、最普遍的一种损伤。现就其机制做一综述。

1 自由基机制和氧化损伤

正常情况下，视网膜色素上皮细胞、杆状细胞、锥体细胞处在一个高张氧环境中，而且感光细胞外节盘膜中含有高水平的长链多不饱和脂肪酸－二十二碳六烯酸，其对感光细胞具有保护作用，但对过氧化反应很敏感。在视网膜退行性变及老年性黄斑变性发病过程中，慢性持续的光损伤会使眼内自由基的浓度增加，并且打破了原有的生理平衡［10］。研究表明适当频率的光子和氧分子在视网膜外层的结合可促发光动力反应，产生单线态氧、过氧化氢及羟基自由基等一系列自由基，这些自由基除对蛋白质及核酸造成损伤外，还能作用于感光细胞－色素上皮复合体的盘膜以及线粒体和内质网膜的多价不饱和脂肪酸，使其发生过氧化反应，从而导致感光细胞外段解体、内节线粒体肿胀变性，呼吸链生理功能也随之降低。此外，脂质过氧化产物中的醛类化合物也有细胞毒性，如丙二醛可作为交联剂与蛋白质、核酸等含氮化合物反应，之发生交联而丧失功能［11］。

2 钙离子的作用

Li等在动物实验中发现，如果在光照前同时给予自由基清除剂二甲基硫脲（DMTU）和钙离子阻滞剂氟桂利嗪（flunarzine），光照后视网膜色素上皮细胞、感光细胞的形态较单用其中一种药物时保存得更加完整，且感光细胞外节的视紫红质水平也较对照组为高。因为实验中所用的DMTU 已达到饱和剂量，故Li等推测细胞内Ca2＋水平的增高和自由基的形成是导致视网膜光损伤的两个不同的机制［12］。关于Ca2＋损伤感光细胞的机制，目前认为其浓度的增高可激活Ca2＋依赖的一些与凋亡有关的酶，而导致视网膜细胞发生凋亡［7］。其次，过多的Ca2＋还促使黄嘌呤脱氢酶转变成黄嘌呤氧化酶，导致氧自由基的形成，氧自由基引起的脂质过氧化又可造成大量的钙内流，进一步加重光损伤的程度。

3 眼部色素与视网膜损伤

黑色素和脂褐素是眼色素膜（脉络膜、睫状体和虹膜）及视网膜色素上皮（RPE）中常见的两种颗粒状物质。黑色素可吸收大量的可见光，对眼有一定的保护作用。此外，黑色素还可结合具有氧化还原活性的重金属离子如Fe2＋，螯合状态的金属离子可减少对色素上皮的损伤［13］。但也有研究表明黑色素在长期的强光照射下能将氧分子还原成超氧阴离子和过氧化氢，对眼产生光毒性反应。

脂褐素（1ipofuscin，LF）在色素上皮中的含量仅次于黑色素，它是RPE 细胞吞噬和消化杆细胞、锥细胞外节的残留物。脂褐素能产生荧光物质，是视网膜中主要的生色团，在有氧的条件下，它可激发细胞色素C的光还原作用产生单线态氧、超氧阴离子和过氧化氢等活性氧来损伤组织［14－15］。LF 的光敏反应还可导致脂质过氧化，使丙二醛等细胞毒性物质含量增加［14］。因此，LF 作为一个潜在的光敏分子，增加了视网膜光损伤的危险性。现已证实［15］，LF的不断累积与年龄相关性黄斑变性中视网膜色素上皮的破坏有密切关系。

4 Müller细胞与神经营养因子的作用

实验表明将脑源性神经营养因子（BDNF）、神经营养因子－3（NT－3）、睫状神经营养因子（CNTF）、神经生长因子（NGF）等注入玻璃体腔中可明显延缓遗传性和光导致的视网膜感光细胞的变性坏死，但正常视网膜光感受器上并不存在此类神经营养因子受体［16］，上述因子的作用机制被认为是通过Müller细胞来发挥作用［17］。Müller细胞是存在于内核层中的一种视网膜特有的胶质细胞，在视网膜中发挥支持、营养、绝缘和保护等重要作用。光致视网膜变性可上调Müller 细胞表面的神经营养因子p75（p75NTR）［18］和酪 氨酸激 酶受体C（Trk C）［19］水平。张纯等［20］观察大鼠视网膜光损伤后Müller细胞增殖，表明Müller细胞参与了光损伤性视网膜变性。

5 凋亡在视网膜光损伤中的作用

细胞凋亡不但参与了视网膜形态发生和组织重建［21］，同时也存在于多种视网膜病理过程中［22］。有研究表明，在各种遗传性视网膜色素变性和光致视网膜损伤中，凋亡是感光细胞和色素上皮细胞丢失的主要机制［23］。目前，在视网膜光损伤中可能具有调控细胞凋亡作用的基因有以下几种：

5.1 p53

p53是一种肿瘤抑制基因，它定位于人类染色体17P13.1。其产物p53 蛋白主要功能是感受DNA 或其它形式的细胞损伤信号，从而决定细胞在G1／S期生长停滞抑或引起凋亡。Marti［24］等将暗适应的野生型p53（＋／＋）和基因敲除p53（－／－）小鼠置于8500～15000lux的白光下照射2h 后，两组动物在形态、组织化学和视网膜电流图（ERG）方面得到相同的变化：光镜下可见到两者外核层的感光细胞浓缩深染；TUNEL 染色能检测到大量的阳性细胞核存在；凝胶电泳显示有典型的DNA 梯带出现，ERG 的a、b、c波幅和振荡电位亦都明显下降。而在未受光照的p53（＋／＋）和p53（－／－）对照组中，两者感光细胞的结构和功能也不存在显著性差别。结果表明p53的缺失并不影响正常的视网膜功能，光导致的感光细胞凋亡也不依赖于功能性p53的存在。Lansel［25］等在对正常的和p53缺失的C57BL／6J小鼠实验中也证实了上述结果。

5.2 bcl－2家族

bcl－2是Tsujimoto等从伴有t（14，18）染色体易位的滤泡状B 细胞淋巴瘤中发现的，定位于18q2l，它的表达可增加细胞对多重促凋亡因素的抗性，抑制多种因素造成的神经细胞凋亡［26］。1993年Boise发现与bcl－2功能相同的bcl－XL基因［7］。Chen［27］等将鼠视蛋白基因5′－ 侧翼区的启动子序列与人的bcl－2cDNA 融合，构建在感光细胞中可过度表达bcl－2的转基因鼠模型，发现bcl－2不但能阻止由视紫红质及杆体细胞cGMP 磷酸二脂酶基因缺陷造成的遗传性视网膜变性，而且还可降低强光照射下感光细胞凋亡的发生率。他认为感光细胞中高表达的bcl－2较正常内源水平的bcl－2更能有效地抑制各种视网膜变性中凋亡的发生。

但也有相反的报道，Joseph［28］将感光细胞中表达有bcl－2及同源蛋白bcl－XL的转基因鼠分别与携有rd／rd基因突变的小鼠或显性视紫红质基因突变小鼠杂交，组织学和ERG 的结果表明bcl－2和bcl－XL 的过量表达并不能阻止上述两种鼠中感光细胞的变性，原位末断标记也显示有凋亡相关的DNA片段形成。但在强光照射2h 后，bcl－2转基因鼠的视网膜中央区域保留有大约4 行感光细胞，而bcl－XL转基因鼠和同窝正常的未转基因鼠未显示出对光的抵抗性，其感光细胞被全部破坏。实验中发现bcl－2转基因鼠中有视紫红质含量的下降，而这在bcl－XL小鼠中没有见到，因此他认为bcl－2 和bcl－XL 的大量表达并不能阻止这两种基因突变造成的感光细胞凋亡，而bcl－2转基因小鼠对光损伤所具有的抵抗力来源于视紫红质含量的降低，并非是bcl－2的抗凋亡作用，在遗传和外界物理因素导致的感光细胞凋亡中并不存在bcl－2的调控。

5.3 c－fos

原癌基因c－fos也已发现有诱导神经细胞凋亡的作用［29］。其编码的产物c－Fos蛋白是转录因子活化蛋白－1（AP－1）复合体中的一员，AP－1参与调控视网膜中多种基因的表达.最近的研究表明，c－Fos在光诱导的感光细胞凋亡中有必不可少的作用。Hafezi［23］等将c－fos基因敲除的小鼠c－fos（－／－）和野生型小鼠c－fos（＋／＋）同时暴露于5000lux的白光下2h后，发现c－fos（＋／＋）鼠有大量感光细胞凋亡，而c－fos（－／－）鼠的视网膜不受影响。因为c－Fos在调节杆细胞特异性基因表达的过程中有重要作用，人们推测c－fos（－／－）鼠所表现的对凋亡的抗性可能与c－Fos功能缺失而导致小鼠视网膜感光细胞吸收光子及光转导能力的下降有关。但是Kueng Hitz［30］等的实验结果证实上述这两种基因型小鼠的杆细胞有相同的光吸收能力，因此c－fos（－／－）小鼠对光诱导凋亡的抗性源于在凋亡级联反应中c－Fos的缺乏，并不是由杆细胞正常生理功能下降所致.Poon［31］等使用组织化学法和TUNEL法分别同时标记c－fos和DNA 断端，结果显示c－fos阳性核与TUNEL 阳性核相对应，进一步证明了cfos与光感受器细胞凋亡的关系。总结视网膜光损伤是一多因素导致的病变，其发生机制已非常复杂，目前光学仪器在眼科的广泛应用，激光手术和白内障摘除人工晶体植入手术的广泛开展开展，医源性光损伤越来越受到人们的重视。随着视网膜光损伤机制研究的深入以及光诱导感光细胞凋亡过程中分子事件的日益明确，为其防治提供理论基础，相信必将为临床治疗该类疾病提供更为有效的手段和措施。

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