巨噬细胞表型偏移相关标志物在大鼠心肌梗死区的动态表达

张 玲 ，罗悦晨 ，周 欣 ，李玉明

（1.天津医科大学研究生院，天津 300070；2.武警后勤学院附属平津医院心脏中心，武警部队心血管病研究所，天津 300162）

近年来的研究显示单核巨噬细胞在心肌梗死后的炎症反应和组织修复中发挥着重要的作用[1-3]。巨噬细胞有M1（经典激活型，classical activation macrophages）和 M2（替代激活型，alternative activationmacrophages）[4-11]两种表型。这两种表型细胞在急性心肌梗死（acutemyocardial infarction，AMI）后的心肌修复过程中发挥着相辅相成的作用，包括清除细胞碎片、促进血管生成、成纤维细胞激活和增殖以及促进胶原代谢等病理生理学变化。本文旨在探讨AMI后不同时间点梗死区内巨噬细胞表型偏移相关标志物[趋化因子配体-2（Ccl2）、趋化因子配体-5（Ccl5）、精氨酸酶-1（Arg-1）以及白介素-10（IL-10）]的变化规律，为以巨噬细胞表型变化为靶点的干预策略提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 成年雄性清洁级Wistar大鼠，周龄 6～8周，体重 170～200 g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，许可证号：SCXK-（军）2007-004。

1.2 主要试剂和仪器 TRIZOLReagent（美国Invitrogen M-MLV Promega SYBR green（瑞士Roche），小动物呼吸机（美国HARVARD），心电监测仪（美国 BioPAC Systems），紫外分光光度计（美国Thermo-Fisher），ABI7300荧光定量PCR仪（美国Applied Biosystems）。

1.3 AMI模型建立 按照本实验室建立AMI模型的方法[12]，主要步骤如下：腹腔注射0.4%戊巴比妥钠（40mg/kg）麻醉动物，连接心电监测仪，沿胸骨左缘剪断左侧第4肋骨，钝性分离心包膜，快速将心脏挤出胸腔，结扎冠状动脉前降支根部，结扎成功后可见心电图示ST段进行性弓背样抬高，然后迅速将心脏放回胸腔；假手术组只开胸挤出心脏后穿缝合线，但不结扎。术后分别于6 h、24 h及6 d取材，梗死组和假手术组每个时间点3～4只，并将标本放于液氮冻存备用。

1.4 Ccl2、Ccl5、Arg-1、IL-10mRNA 表达水平的测定 按照TRIZOLReagent说明书提取梗死区心肌组织总RNA，提取后的RNA用紫外分光光度计测定浓度和纯度（OD260/280及260/230比值），琼脂凝胶变性电泳鉴定RNA，然后反转录合成cDNA，分装，-70℃保存。按照FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）试剂说明书进行real-time PCR，主要如下：反应体系为20μL，包括SYBR Green Master（ROX）10μL、5μmol/mL 的上、下游引物（序列详见表1）各1μL、cDNA模板1μL、高压超纯水7μL；反应条件：50℃ 2min，95℃10min，95℃15 s，60℃1min，共40个循环。设双复孔，β-actin作为内参。溶解曲线由PCR仪自动生成。获得心梗组和假手术组样本中的目的基因及内参基因的相对表达量，使用2-ΔΔCt方法比较两组目的基因的表达情况，ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct内参基因）心梗组-（Ct目的基因-Ct内参基因）假手术组。各组计算 2-ΔΔCt均数及标准差。

表 1 Ccl2、Ccl5、Arg-1、IL-10 和 β-actin 基因引物序列Tab 1 Nucleotide sequenceof specific primers for real-time PCR of Ccl2,Ccl5,Arg-1,IL-10 andβ-actin

2 结果

2.1 M1偏移标志物Ccl2和Ccl5mRNA的表达水平 与假手术组相比，心肌梗死组Ccl2mRNA表达量在6 h开始增高，24 h达到高峰（分别是假手术组的2.3倍和4.29倍，P<0.05），6 d时表达水平下降（P>0.05）（图1A）。而 Ccl5mRNA在6 h时与假手术组相比无明显变化（P>0.05），24 h表达水平明显升高，达到假手术组的2倍（P<0.05），6 d时下降（图1B）。

2.2 M2偏移的标志物Arg-1和IL-10mRNA的表达水平 与假手术组相比，Arg-1和IL-10的表达水平在24 h和6 d明显升高。Arg-1在24 h较假手术组升高了14.5倍，并持续升高至6 d（P<0.05）；IL-10在24 h和6 d分别较假手术组升高了10.3倍和 2.9倍（P<0.05）（图 2A-B）。

图1 巨噬细胞M 1偏移相关标志物Ccl2和Ccl5的动态表达情况Fig 1 The dynam icmRNA expression of Ccl2 and Ccl5 for M 1 macrophage

图2 巨噬细胞M 2偏移相关标志物Arg-1和IL-10的动态表达情况Fig 2 Thedynam icm RNA expression of Arg-1 and IL-10 for M 2 m acrophage

3 讨论

本实验结果显示：在AMI6 h时，代表M1型巨噬细胞的炎症因子Ccl2和Ccl5表达水平升高，24 h时达到峰值，6 d左右回落。而代表M2型巨噬细胞的细胞因子Arg-1和IL-10在心肌梗死后24 h至6 d左右的时间窗内表达量升高。由此可以看出心肌梗死后不同表型的巨噬细胞浸润心肌组织的时间序贯性：前期主要是M1型巨噬细胞浸润，后期则是M2型发挥作用。

巨噬细胞在AMI后的病理学变化阶段中发挥着不可或缺的作用[13]。在心肌细胞坏死数小时内，巨噬细胞渗入梗死心肌区，行使复杂的修复功能[14-15]。研究者在小鼠心梗模型[1-2]中发现：小鼠心梗1～3 d内梗死区有Ly-6Chi型单核细胞（对应人类的M1型巨噬细胞）浸润，4～6 d时心梗区浸润的单核细胞为Ly-6Clow表型（对应人类的M2型巨噬细胞）。同时还证实Ly-6Chi型单核细胞是促炎症细胞，帮助清除细胞碎片，加剧细胞破坏胞外基质。而Ly-6Clow型单核细胞能够抑制炎症反应，促进心肌细胞外基质再生和血管新生。因此我们可以推断参与心肌修复的单核巨噬细胞随时间变化会发生表型偏移，同时发挥着相辅相成的心肌修复功能。通过对M1、M2型巨噬细胞生物标志物动态表达水平的检测，本文第一次在基因水平上佐证了两型细胞在心肌梗死后能够有序地浸润梗死区组织。

认识心梗后巨噬细胞表型的偏移规律对心肌梗死的临床治疗学具有潜在指导意义。AMI后大多伴随心室重塑。即使及时开通冠状动脉罪犯血管，某些AMI患者也会发生心力衰竭。这与过度的炎症反应之间存在一定联系。过度炎症反应会加重组织损伤，延缓组织修复，促使左心室扩张变形以致发生心力衰竭。因此，如能在心肌梗死初期适度控制M1型巨噬细胞活性，或者促使巨噬细胞由M1表型向M2型转化将有助于改善心梗预后。

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