HPLC法测定香兰素衍生物片中香兰素衍生物含量

杨琳沐 肖炳坤 杨建云 黄荣清

1.解放军总医院，北京 100853；2.军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京 100850

香兰素衍生物是由香草醛经过取代反应及甲氧基化反应合成的[1]。目前广泛用于医药、香料、农药、有机合成及药用辅料等领域。另经研究发现，香兰素衍生物能清除自由基，具有良好的抗氧化活性[2-3]，对细胞基因组织损伤和细胞凋亡均有良好的保护作用[4]，能够促进DNA双链断裂损伤修复，有效防护细胞凋亡和基因损伤[5]，作为一种食品添加剂和香料，其毒性较低，气味芳香，服用顺应性好[6]，作为一种低剂量辐射损伤保护剂，极具开发前景。本文建立了一种高效液相色谱法测定其片剂中香兰素衍生物的含量，此方法简便、快捷，具有较高的专属性和灵敏度，为片剂质量标准的制订提供了有力的依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪（Waters2695四元泵，2996二极管阵列检测器，美国Waters公司），Empower数据处理系统（美国Waters公司）；BP211D型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；KQ-3200超声清洗仪（昆山市超声仪器有限公司），LDZ5-2医用离心机（北京医用离心机厂）。

1.2 试药

香兰素衍生物片（规格：50 mg， 批号：100304、101019、111028，军事医学科学院放射与辐射医学研究所提供），香兰素衍生物对照品（批号：091206，军事医学科学院放射与辐射医学研究所提供），甲醇（色谱纯，安徽时联特种溶剂有限公司）；水（杭州哇哈哈集团有限公司）；冰醋酸（分析纯，北京化工厂）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Zorbax C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）色谱柱；流动相：甲醇-0.002%醋酸（40︰60）；流速：1.0 mL/min；检测波长：306 nm；柱温：35℃；进样量 20 μL。

2.2 专属性实验

2.2.1 空白辅料按照处方量配制辅料，精密称取辅料约15 mg，置25 mL量瓶中，加适量甲醇，超声30 min，放冷至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.22 μm）过滤。精密移取滤液5 mL，置25 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。取20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，见图1（A）。取流动相甲醇-0.002%醋酸（40︰60）20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，见图1（B）。结果表明，片剂辅料无干扰。

2.2.2 香兰素衍生物对照品储备液制备 精密称取香兰素衍生物对照品约20 mg，置50 mL量瓶中，加适量甲醇溶解，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成1 mL含香兰素衍生物约0.4 mg的溶液，即得。

2.2.3 对照品溶液制备 精密移取“2.2.2”项下香兰素衍生物对照品储备液5 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。取20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，见图1（C）。

2.2.4 样品溶液制备 取香兰素衍生物片10片（批号：101019），研细，精密称取片粉约25 mg（相当于香兰素衍生物约10 mg），置25 mL量瓶中，加适量甲醇，超声振荡30 min，放冷至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.22 μm）过滤，精密移取上清液5 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，即得。取20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，见图1（D）。

图1 流动相、辅料、对照品、及样品溶液高效液相色谱图

2.3 线性关系考察

精密量取“2.2.2”项下储备液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL，分别置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成系列浓度的标准溶液。分别取20 μL注入液相色谱仪。以溶液浓度X（mg/mL）为横坐标，峰面积Y为纵坐标作线性回归，得回归方程为 Y=1.15×108X+3.66×106（r=0.999 6，n=7）。 结果表明：香兰素衍生物浓度在0.02～0.14 mg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.4 精密度试验

精密移取“2.2.2”项下储备液5 mL置25 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，得对照品溶液。取对照品溶液20 μL注入液相色谱仪，连续进样6次，记录色谱图，香兰素衍生物峰面积RSD为0.07%，表明此方法精密度良好。

2.5 重复性试验

取香兰素衍生物片10片（批号：101019），研细，精密称取片粉约25 mg（相当于香兰素衍生物约10 mg），共6份，按“2.2.4”项下操作，制得样品溶液，分别取 20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，以外标法计算香兰素衍生物百分含量，平均含量为99.1%，RSD为0.70%（＜1%），表明方法重复性良好[7]。

2.6 稳定性试验

取“2.2.3”项下的对照品溶液及“2.2.4”项下的样品溶液，在室温下放置 2、4、6、8、10 h，分别取 20 μL，注入液相色谱仪，记录峰面积，峰面积RSD分别为0.28%和0.05%，结果表明溶液在10 h内稳定。

2.7 加样回收率试验

采用回收法，精密称取片粉约25 mg，分别加入对照品适量，置50 mL量瓶中，按“2.2.4”项下操作，测定回收率。见表1。

表1 加样回收率测定结果（n=9）

2.8 样品含量测定

精密称取样品片粉适量（约相当于香兰素衍生物10 mg），按“2.2.4”项下操作，记录色谱图，按外标法以峰面积计算含量，结果三批样品含量分别为标示量的99.3%，100.8%和99.6%，平均含量为99.9%，RSD为0.79%。

3 讨论

3.1 检测波长的选择

取对照品溶液在200～800 nm范围内进行扫描，在215、230、306 nm处有最大吸收。在215 nm处流动相有较强的背景吸收，易干扰测定。230 nm处为一肩峰，吸光度值变化较大，也不适合作为检测波长。故检测波长定为306 nm。

3.2 流动相的选择

参考有关文献[8-9]，考察了乙腈-水系统，甲醇-水系统，甲醇-异丙醇-水系统，甲醇-水-乙二胺系统及甲醇-水-冰醋酸系统。试验结果显示，乙腈-水系统出峰时间过早，但是甲醇-水系统峰形不够理想。在甲醇-水系统中加入异丙醇，对峰形均无明显改善，而在系统中加入乙二胺后，主成分出峰时间过早。最终通过改变冰醋酸的浓度，使峰形对称度良好并且理论塔板数大于5 000。最终确定了流动相组成为甲醇-0.002%醋酸（40︰60）。

3.3 溶剂的选择及样品处理

香兰素衍生物在甲醇中溶解，在水中几乎不溶，故先加入适量甲醇，并超声30 min，使片粉中的主药成分充分溶解，再加入甲醇稀释至刻度，以减少样品溶液中淀粉等多糖类辅料的溶解，延长色谱柱使用寿命。在进样前以孔径为0.22 μm的滤头过滤，防止样品中不溶于甲醇的成分影响测定结果或堵塞液相色谱系统。

[1]张万宏，李财林，雷志刚.对羟基苯甲醛合成方法概述[J].化工生产与技术，2006，13（1）：45-47.

[2]郑红.香兰素衍生物Dimovanin的辐射防护剂作用机制研究[D].合肥：安徽医科大学，2006.

[3]郑红，汪思应，严雨倩，等.香兰素衍生物对辐射损伤细胞保护作用的初步研究[J].辐射防护，2008，28（4）：226-231.

[4]黄睿，贺性鹏，徐勤枝，等.香兰素衍生物VND3207对γ射线照射人淋巴母细胞基因组损伤和凋亡的保护作用[J].辐射防护，2009，29（4）：225-231.

[5]陈倩倩，汪黎，尚增甫，等.香兰素衍生物VND3207对α粒子辐射诱发人成纤维细胞基因组DNA损伤的防护研究[J].科技导报，2010，28（4）：31-36.

[6]史晓佩，王潇，孔福全，等.7Li离子辐照对SH-SY5Y细胞的损伤效应及香兰素衍生物的辐射保护作用[J].中国原子能科学研究院年报，2009：184-186.

[7]国家药典委员会.中国药典[S].二部.北京：中国医药科技出版社，2010：665.

[8]刘玉明，张术，黄来龙，等.毛细管气相色谱法测定肤疾安药物中香兰素的含量[J].药物分析杂志，2010，30（2）：336-338.

[9]金海涛，马建瑜，王晓珣，等.高效液相色谱法同时测定香兰素与邻位香兰素[J].分析测试学报，2011，30（2）：222-224.