硫酸软骨素酶高产菌株的筛选、鉴定和发酵培养条件的研究＊

刘万顺，付静芸，常 菁，杨 艳，韩宝芹

（中国海洋大学海洋生命学院，山东 青岛266003）

硫酸软骨素酶（Chondroitinase）能特异地降解硫酸软骨素为不饱和二糖及寡糖，硫酸软骨素酶有多种重要用途，在基础研究中它用来构建二糖和寡糖的基因文库［1］，用来研究糖胺多糖结构和性质［2］。近年来，该酶在临床领域的研究非常活跃，包括对细胞外基质代谢相关疾病，如大骨节病的防治［3］，对糖胺多糖与肿瘤等疾病发生关系的研究［4］，阻止玻璃体与视网膜的粘连［5］，促进神经轴的再生［6］以及增强软骨细胞与软骨的粘附力［7］等。因此，对硫酸软骨素酶的分离纯化具有重要的理论和现实意义。

微生物是硫酸软骨素酶的主要来源，国外主要从微生物中提取硫酸软骨素酶来获得高纯度的酶制剂，已报道的产酶菌株主要有普通变形杆菌（Proteus vulgaris）［8］，肝 素 黄 杆 菌 （Flavobacterium heparinum）［9］，奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）［10］等。目前国内没有硫酸软骨素酶产品供应，全部依靠进口，价格昂贵。本文分离到产硫酸软骨酶活力较高的菌株，对该菌进行了初步鉴定和产酶条件优化，以期为发酵制备硫酸软骨素酶奠定一定的基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

硫酸软骨素为市售食品级，其余试剂均为国产分析纯商品试剂。

1.2 培养基

（1）平板分离培养基、斜面培养基（%，w／v）（NH4）2SO41，硫酸软骨素 0.5，NaCl 0.5，KH2PO40.03，琼脂2，其余为水，调pH 至7.0。

（2）初筛培养基（%，w／v） 平板分离培养基＋Albumin bovine V（牛血清白蛋白第五组份）1，调pH至7.0。

（3）复筛培养基（%，w／v） 硫酸软骨素0.5，NaCl 0.5，KH2PO40.03，MgSO4·7H2O 0.5，以（NH4）2SO41或NaNO31或蛋白胨1或酵母粉1或牛肉膏1为氮源，其余为水，调pH至7.0。

（4）液体种子培养基、发酵培养基（%，w／v） 蛋白胨1，硫酸软骨素0.5，NaCl 0.5，KH2PO40.03，MgSO4·7H2O 0.5，其余为水，调pH 至7.0。

1.3 产酶菌株的筛选

1.3.1 初筛 将采集到的土样用无菌水进行悬浮并稀释，涂布平板分离培养基，30℃培养3～4d，划线法将得到的单菌落在平板分离培养基上进行纯化；参照文献［11］，纯化后的单菌落转接到初筛培养基中，30℃培养3～4d后，向平板表面倒入5mL 2mol／L的冰醋酸，观察有无透明圈，高分子量的硫酸软骨素具有大量的负电荷，可与小牛血清第五组分结合形成能与冰醋酸混合发生浊度反应的复合物，硫酸软骨素酶则会使复合物中硫酸软骨素降解，形成透明圈，因此有透明圈则说明有硫酸软骨素酶活性，然后把筛选得到的有透明圈的菌落转接到斜面培养基上保存。

1.3.2 复筛 挑取新鲜斜面种子一环接入复筛培养基中，30℃130r／min摇床培养24h，菌体密度经平板菌落计数为（2～3）×107个／mL（以下种子菌液同），以2.0%的接种量接入复筛培养基中，30℃摇床培养72h，发酵液经6 000r／min离心10min，取上清液测酶活，每12h测一次。

1.4 酶活力的测定

参照Saito.H［2］的方法进行酶活力的测定。取0.1mL离心的发酵上清液、3.9mL 0.02mol／L Tris－HCl（pH＝7.5）和4mL 0.2%硫酸软骨素，加入比色管中，37℃水浴反应20min后，立即置于沸水浴中煮沸5min，对照管以相同的条件加入灭活的发酵上清液，在232nm处测定光吸收值。蛋白质含量的测定采用Lowry法。

酶的活力单位U定义为37℃条件下，每分钟催化形成1μmol不饱和双糖的酶量。相对酶活（%）是指在单因子发酵产酶影响试验中，该因子各水平发酵液的酶活力与该因子最高产酶水平发酵液的酶活力的比值。酶活力单位的计算公式为：

式中：A指232nm处不饱和二糖的吸光值；ε指毫摩尔消光系数，一般是5.1；d指所用石英比色皿的厚度，一般是1cm；t指反应的时间（min）；Vt指反应的总体积（mL）；Vs指样品的体积（mL）。

1.5 产酶菌株的鉴定

将复筛得到的产硫酸软骨素酶活力高的菌株进行形态、革兰氏染色等常规检查，并选用纯化培养物，利用法国梅里埃全自动微生物鉴定系统Vitek2的API 20NE手工编码鉴定进行生理生化特性考察。

1.6 菌株生长曲线的测定

将新鲜斜面种子挑取一环接入复筛培养基中，30℃，130r／min摇床培养24h作为种子菌液，然后以2.0%的接种量接入复筛培养基中，30℃，130r／min摇床培养，每隔12h取样测定580nm处的OD580，绘制生长曲线。

1.7 发酵培养条件的研究［12－13］

1.7.1 最适碳源的选择 在发酵培养基中，分别以1.0%蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、乳糖、果糖、木糖或可溶性淀粉代替发酵培养基中的硫酸软骨素作为碳源，按2.0%的接种量接入种子菌液，于130r／min，30℃摇床培养48h后，测定发酵液酶活力，试验不同碳源对产酶的影响。

1.7.2 最适氮源的选择 在发酵培养基中，分别以1.0%尿素、硫酸铵、蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、硝酸钠、磷酸二氢铵或硝酸铵作为氮源，按2.0%的接种量接入种子菌液，于130r／min，30℃摇床培养48h后，测定发酵液酶活力，试验不同氮源对产酶的影响。

1.7.3 最适氮源浓度的选择 在发酵培养基中，分别设置氮源浓度为0.5%，1.0%，1.5%和2.0%，按2.0%的接种量接入种子菌液，于130r／min，30℃摇床培养48h后，测定发酵液酶活力，试验不同氮源浓度对产酶的影响。

1.7.4 最适培养基起始pH值的选择 将发酵培养基的起始pH 值分别调至4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，8.5，9.0，9.5和10.0，按2.0%的接种量接入种子菌液，于130r／min，30℃摇床培养48h后，测定发酵液酶活力，试验培养基的起始pH值对产酶的影响。

1.7.5 培养基装量对产酶的影响 在250mL的三角瓶中，分别装入10，20，30，40，50，60和70mL发酵培养基，按2.0%的接种量接入种子菌液，于130r／min，30℃摇床培养48h后，测定发酵液酶活力，试验培养基装量对产酶的影响。

1.7.6 接种量对产酶的影响 在发酵培养基中，分别按1.0%，2.0%，3.0%，4.0%，5.0%，6.0%（v／v）的接种量接入种子菌液，于130r／min，30℃摇床培养48h后，测定发酵液酶活力，试验接种量对产酶的影响。

1.7.7 培养温度对产酶的影响 在上述优化条件下，分别设置培养温度为15，20，25，28，30和32℃，于130r／min摇床培养48h后，测定发酵液酶活力，试验培养温度对产酶的影响。

1.7.8 摇床转数对产酶的影响 在上述优化条件下，分别设置摇床转数为80，100，130，150和180r／min，于最适温度下摇床培养48后，测定发酵液酶活力，试验摇床转数对产酶的影响。

1.7.9 培养时间对产酶的影响 在以上最优化条件的基础上，在250mL三角瓶中进行发酵，分别在8，12，16，20，24，36，48，60和72h取发酵液测酶活，试验培养时间对产酶的影响。

2 结果与分析

2.1 产酶菌株的筛选

2.1.1 菌株初筛结果 通过平板划线分离筛选到2株产硫酸软骨素酶能力较强的菌株，在以硫酸软骨素为唯一碳源的平板分离培养基上在菌落周围产生较大的透明圈，分别编号为5号和28号，如图1所示。没有被酶解的大分子硫酸软骨素能与Albumin bovine V结合并形成白色沉淀，而被菌体分泌的酶所降解形成的小分子硫酸软骨素不能与Albumin bovine V结合，使菌落周围能形成透明斑。

图1 平板初筛结果Fig.1 Primary screening results of plate culture

2.1.2 菌株复筛结果 将已纯化的具有较好产硫酸软骨素酶能力的2株菌进行摇瓶复筛，选取不同的氮源，结果显示2种菌株在含有机氮的培养基中酶活都比较高，其中28号菌株在硫酸铵为氮源的培养基中也有较好的产酶能力，如图2所示，故将28号菌株作为进一步研究的实验菌株。

图2 摇瓶复筛结果Fig.2 Secondary screening results of shaking culture

2.2 菌株鉴定结果

将经过初筛和复筛的28号菌株进行菌株鉴定。

2.2.1 形态特征 菌落黄色，近圆形，表面光滑、湿润、不透明，边缘整齐，略突起，直径约0.2～0.3mm，菌体为杆状，无孢子。

2.2.2 生理生化特征 革兰氏反应阴性，需氧非发酵型，氧化酶测定阳性，可氧化利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、海藻糖、纤维二糖，不能利用柠檬酸盐，甘氨酸芳胺酶、酪氨酸芳胺酶和脯氨酸芳香胺基酶呈阳性，谷氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、脂酶和脲酶呈阴性，鉴定编码为1601315150721001，鉴定度＝99.8（既极好的鉴定）。根据各项指标的测定结果，28号菌株初步鉴定为少动鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas paucimobilis）。

2.3 菌株生长曲线

菌株生长在36h之前已进入稳定期，之后菌体密度不再随培养时间的延长而有明显增加，且处于稳定期的时间较长，见图3。

图3 28号菌株生长曲线图Fig.3 Growth curve of strain 28

2.4 发酵条件的研究

2.4.1 最适碳源的选择 不同碳源的产酶影响如图4所示，以硫酸软骨素为碳源发酵液的酶活力最高，其次是乳糖、果糖、蔗糖，硫酸软骨素是最适碳源。

图4 不同碳源对菌株产酶的影响Fig.4 Effects of various carbon sources on chondroitinase production

2.4.2 最适氮源的选择 不同氮源的产酶影响如图5所示，有机氮作为氮源比无机氮作为氮源更有利于产酶，又以酵母粉最有利于产酶，其次是蛋白胨和牛肉膏。

图5 不同氮源对菌株产酶的影响Fig.5 Effects of various nitrogen sources on chondroitinase production

2.4.3 最适氮源浓度的选择 以酵母粉为氮源的不同氮源浓度对产酶的影响如图6所示，当酵母粉浓度为1.0%时最有利于产酶。

图6 不同氮源浓度对菌株产酶的影响Fig.6 Effects of different yeast extract concentration on chondroitinase production

2.4.4 最适培养基起始pH的选择 结果如图7所示，培养基的起始pH在6.0～10.0范围内酶活力均比较高，在pH＝8.5时酶活力最高；当pH≤4.0时，酶活力很低。

图7 培养基起始pH对菌株产酶的影响Fig.7 Effects of initial pH of medium on production

2.4.5 培养基的装液量对产酶的影响 结果如图8所示，使用250mL的三角瓶，装量在20～60mL时产酶活力均较高，最适装量为40mL。

图8 装液量对菌株产酶的影响Fig.8 Effects of liquid volumes on chondroitinase production

图9 接种量对菌株产酶的影响Fig.9 Effects of amount of inoculation on chondroitinase production

2.4.6 接种量对产酶的影响 结果如图9所示，接种量对产酶的影响不大，当接种量为1%时，酶活力最高，随着接种量的加大，酶活力随之降低，所以接种量为1%最有利产酶。

2.4.7 培养温度对产酶的影响 结果如图10所示，试验表明在20～30℃范围内培养时酶活力相对较高，发酵培养温度为25℃时，发酵液的酶活力最高。

图10 培养温度对菌株产酶的影响Fig.10 Effects of culture temperature on chondroitinase production

2.4.8 摇床转数对产酶的影响 结果如图11所示，试验表明较高的摇床转数不利于产酶，当摇床转数在80～130r／min范围内时，酶活力比较高，以100r／min最有利于产酶。当摇床转数高于130r／min时，酶活力开始降低。

图11 摇床转数对菌株产酶的影响Fig.11 Effects of revolutions per minute on chondroitinase production

2.4.9 培养时间对产酶的影响 结果如图12所示，试验表明随着培养时间的延长，酶活力不断增加，培养至36h时酶活力达到最大值，之后较长的时间内产酶能力都很稳定。

图12 培养时间对菌株产酶的影响Fig.12 Effects of culture time on chondroitinase production

3 讨论

本研究中，28号菌株在以硫酸软骨素为唯一碳源的平板上生长产生的透明圈直径与菌落直径的比值（D／d）较大，摇瓶复筛的结果表明其酶活力也较高，而且以有机氮为氮源的发酵液酶活力要比无机氮的高很多。但值得注意的是，虽然5号菌株的透明圈直径与菌落直径的比值（D／d）较小，摇瓶复筛结果却表明其酶活力在有机氮中也较高，而且以牛肉膏为氮源时酶活力比28号菌株的要高。因此，菌株的D／d值的大小并不一定与液体发酵产酶能力的高低相对应，在筛选过程中应结合不同的方法进行筛选，以免漏筛产酶能力强的菌株。

通过对28号菌株的产酶发酵培养条件进行优化，该菌发酵液的酶活力可达1.2U／mL。与Yamagata［8］所报道的肝素黄杆菌（Flavobacterium heparinum）（酶活力为0.026U／mL），普通变形杆菌（Proteus vulgaris）（酶活力为0.06U／mL）以及苏昕等［14］报道的温和气单孢菌（Aeromonas sobria）（酶活力为0.92U／mL）菌株的产酶活性相比，28号菌株的产酶能力强，并且酶活力稳定。结合形态特征和生理生化特性，鉴定该菌株为少动鞘氨醇单胞菌，是好氧菌，迄今尚未见报道。Yamagata［8］所报道的产酶菌株分别为肝素黄杆菌（Flavobacterium heparinum），普通变形杆菌（Proteus vulgaris），奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）等，皆为好氧菌；苏昕等［14］从鱼腹中分离到1株产酶活性较高的温和气单孢菌（Aeromonas sobria），兼性厌氧菌；陶科等［15］从屠宰厂等地筛选到1株产酶活性较高的彭氏变形杆菌（P.penneri），兼性厌氧菌。

将该菌株接种在含有0.5%的硫酸软骨素的发酵液中，与不加硫酸软骨素的对照比较酶活，在含有硫酸软骨素的发酵液中检测到的酶活远远高于不含硫酸软骨素的发酵液中检测到得酶活，故筛选得到的28号菌株所产的硫酸软骨素酶属于诱导酶，而且酶被菌体分泌到胞外，这有利于后期酶的分离纯化。

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