清肺化痰通络方对肺纤维化大鼠基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-9表达的影响

赵敏 陈忻怡 陈振发

[摘要] 目的 探討清肺化痰通络方对博莱霉素A5（BLMA5）所致肺纤维化大鼠的干预作用及可能机制。 方法 将Wistar大鼠随机分为对照组、模型组、干预组。模型组和干预组通过气管插管灌注BLMA5复制大鼠肺纤维化模型，对照组给予等量生理盐水气管灌注；对照组和模型组给予生理盐水灌胃，干预组给予清肺化痰通络方药物灌胃。灌胃后3、7、14、28 d分别处死大鼠，采用HE和Masson染色观察肺组织病理变化，免疫组化染色检测基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、 MMP-9在肺组织的表达水平。 结果 清肺化痰通络方能显著改善大鼠的一般身体状况，减轻肺泡炎及肺纤维化的程度。干预组和模型组肺内MMP-2表达在第14天达到高峰，MMP-9的表达在第7天达到高峰，且两组同时期MMP-2、MMP-9的表达均高于对照组（P ＜ 0.05）；干预组MMP-2、MMP-9表达低于同时期模型组 （P<0.01）。 结论 清肺化痰通络方可能通过抑制MMP-2、MMP-9在肺内的表达，对BLMA5致肺组织纤维化起到一定的防治作用。

[关键词] 肺纤维化；基质金属蛋白酶-2；基质金属蛋白酶-9

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2012）05（c）-0014-03

肺纤维化是多种慢性肺疾病的共同结局，表现为肺间质细胞大量增殖、细胞外基质（ECM） 异常增生及肺组织结构的重构，疾病早期表现为弥漫性肺泡炎，肺泡结构破坏，肺泡上皮细胞和基底膜的损伤是肺间质纤维化病理过程的特征性改变，MMP-2和MMP-9可以降解肺泡壁基底膜的重要成分Ⅳ型胶原，因此，MMP-2和MMP-9在肺纤维化的发生过程中起着重要的作用。清肺化痰通络方是全国名老中医邱幸凡教授的临床经验方，在临床应用中取得了较好疗效。本实验借鉴博莱霉素A5（BLMA5）诱发的大鼠肺纤维化模型，利用免疫组化法检测肺内MMP-2和MMP-9的表达，以探讨清肺化痰通络方防治肺纤维化的作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雌性Wistar大鼠72只，SPF级，体重（200±20）g，购于武汉大学试验动物中心。

1.2 试验药物

清肺化痰通络方由黄芩、瓜蒌、桃仁、地龙、黄芪、当归、鱼腥草（购于湖北省中医院）组成；常规水煎后，水浴浓缩药液至每1 mL含生药2 g，4℃保存。将BLMA5（8 mg/支，天津太和制药有限公司，批号：030705）制成5 mg/mL的生理盐水溶液。MMP-2单克隆抗体（产品编号：ZM-0330）、MMP-9单克隆抗体（产品编号：ZM-0335）及Sp试剂盒（产品编号：SP-9000）由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。

1.3 肺纤维化模型制作

参照文献[1]，将大鼠麻醉，趁动物吸气瞬间，在额镜的直视下迅速将焊锡制成圆头的12号腰穿针头，通过声带插入气管约3~4 cm，缓慢注入BLMA5生理盐水溶液1 mL/kg。立即将大鼠直立旋转。

1.4 动物分组及处理方法

将72只大鼠随机分为三组：① 模型组（24只）：造模2 h后，生理盐水灌胃，15 mL/（kg·d）；② 干预组（24只）：造模2 h后，清肺化痰通络方水煎剂灌胃，15 mL/（kg·d）；③对照组（24只）：不造模，生理盐水灌胃，15mL/（kg·d），灌胃前禁食4 h，不禁水。以上各组动物分别在实验第3、7、14、28天各处死6只。

1.5 标本采集及处理

经0.5%戊巴比妥钠溶液腹腔内注射麻醉后，称重；颈动脉放血处死，10％甲醛溶液固定右肺上叶，制作石蜡切片，用于HE染色和Masson染色及肺组织MMP-2和MMP-9表达检测。

1.6 指标检测

1.6.1 病理染色分析依据Szapiel等[2]方法，确定肺泡炎及肺纤维化程度。①肺泡炎分级，0分：无明显病变；1分：轻度肺泡炎，病变占全肺20%以下；2分：中度肺泡炎，病变局限在全肺20%~50%；3分：弥漫性肺泡炎，病变范围超过50%。②肺间质纤维化分级，0分：无肺间质纤维化；1分：轻度肺间质纤维化，病变范围局限在全肺20%以下；2分：中度肺间质纤维化，病变范围占全肺20%~50%；3分：重度肺间质纤维化，病变范围超过50%，肺泡结构消失，肺组织结构紊乱。

1.6.2 免疫组织化学分析Sp法测定肺组织的MMP-2和MMP-9表达，采用HUMIAS-2000医学图文分析系统，对免疫组织化学结果定量分析。每张切片在高倍视野（×400）下随机选择不相重叠的5个视野，细胞核为蓝色，MMP-2和MMP-9阳性细胞为棕黄色，阴性对照片以PBS替代MMP-2和MMP-9。测定阳性细胞的积分光密度，观察MMP-2和MMP-9免疫阳性细胞的分布，以反映各组肺组织中MMP-2和MMP-9表达的变化。

1.7 统计学方法

采用SPSS 12.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，三组间比较采用单因素方差分析，用q检验进行不同组间的两两比较，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 清肺化痰通络方对肺纤维化大鼠肺组织的影响

2.1.1 肉眼观察对照组可见大鼠肺呈粉红色，表面光滑，弹性良好。模型组第3、7天可见大鼠双肺呈鲜红色，有数个的散在出血点，体积增大，第14天双肺可见暗红色陈旧出血，第28天时双肺苍白、表面凸凹不平、体积缩小、弹性较差，硬度增加。干预组与模型组病变基本一致，但程度稍轻，肺体积略增大，弹性稍差。

2.1.2 镜下观察对照组大鼠肺组织结构清晰，肺泡壁完整，肺泡上皮细胞形态正常，均未见明显病变。模型组第3天时肺内出现肺泡间隔增宽、炎性细胞浸润等急性肺泡炎改变；第7天时炎症表现更明显，镜下见大片炎性细胞浸润，成纤维细胞开始增殖；第14天时肺泡炎持续加重，纤维组织开始增生；第28天肺泡炎较前有所减轻，部分肺泡腔消失，被大量成纤维细胞、增生的胶原纤维所取代，已基本呈现肺纤维化改变。干预组大鼠肺部病理表现的变化规律与模型组基本一致。三组间同时段的肺泡炎程度，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）；干预组和模型组同时段肺泡炎程度差异有统计学意义（P ＜ 0.05），特别是第7天和第14天干预组肺泡炎程度较模型组轻，两组间差异有高度统计学意义（P ＜ 0.01）。干预组和模型组在第3天肺纤维化程度差异无统计学意义（P ＞ 0.05），三组在第7、14、28天的肺纤维化程度，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）；第28天干预组肺纤维化程度较模型组轻，差异有高度统计学意义（P ＜ 0.01）。见表1。

2.2 三組MMP-2和MMP-9蛋白表达比较

对照组肺组织中可见MMP-2少量阳性表达，主要分布在肺泡巨噬细胞、肺泡上皮细胞、成纤维细胞和气道上皮细胞胞浆内。模型组、干预组第3天时，肺内MMP-2阳性表达细胞均多于对照组，肺泡间隔内可见少量成纤维细胞呈阳性反应，血管、支气管周围及肺泡腔镜下内可见大量单核巨噬细胞呈强阳性反应，三组间比较，差异有统计学意义（P ＜0.05）；第7天模型组和干预组MMP-2表达明显增强，可见大量肺泡巨噬细胞和间质内的成纤维细胞呈阳性表达； 第14天模型组和干预组肺内阳性细胞表达最强，与第3、7、28天比较，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）；第28天时，模型组和干预组阳性细胞较同组第14天时明显减少，但仍高于对照组。见表2。

对照组肺内可见MMP-9少量弱阳性表达，表达主要分布于肺胞巨噬细胞和支气管上皮细胞。第3天时模型组、干预组大鼠肺内血管、支气管周围及肺泡腔内的单核巨噬细胞呈强阳性反应，与对照组比较，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）；第7天模型组和干预组肺内MMP-9表达增强，除支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞外，还见大量间质内的成纤维细胞和肺泡巨噬细胞呈阳性表达，与同组第3、14、28天比较，差异有高度统计学意义（P ＜ 0.01）；第14天模型组和干预组肺内阳性细胞略有减少；第28天模型组和干预组MMP-9表达较第7天时明显减弱，但仍高于对照组（P ＜ 0.05）。干预组阳性细胞明显少于同时段模型组，两组间差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。见表2。

3 讨论

现代医家根据肺纤维化临床表现及病机变化将其归为咳嗽、肺胀、喘证、气短、肺痿、肺痹、痰饮等范畴，正气亏虚为本，血瘀内阻为标，正虚邪实为其基本病机，其中，痰阻肺络、肺阴不足、瘀血阻滞、内闭喘脱为临床多见的病变类型。消肿化痰通络方中黄芩、瓜蒌为君药，黄芩味苦寒主入肺经，可泻火解毒，治肺热所致咳吐黄痰；瓜蒌药味甘、微苦，性寒，归肺、胃、大肠经，清热化痰，宽胸散结、痛疮肿毒，两者相伍则肺之热清痰化而气机调畅；鱼腥草味辛，性微寒，归肺经具有清热解毒、消痈排脓功效，肺萎之人久咳入络，必兼气虚血瘀，故以地龙、桃仁活血化瘀、通络，且地龙性寒味咸，善下行可平抑上逆之肺气而止咳平喘；佐以黄芪、当归养血补气，与君药相配，苦寒、甘温并用，使肺热得清而不伤肺津，共奏清热化痰、止咳平喘、活血益气之功。

实验结果显示，造模大鼠均有不同程度的耸毛、活动减少、嗜睡，少吃等症状。造模初期可见大鼠体重明显下降，约3 d后逐渐缓解，其中，干预组体重恢复较快，第28天时体重已与空白对照组相近，而模型组体重恢复较慢，第28天时仍明显低于对照组。通过HE光镜观察模型组早期即出现肺泡炎，14 d后以肺纤维化病变为主，28 d出现典型的肺纤维化改变，符合肺纤维化的病理改变过程[3]，提示造模成功。干预组肺泡炎程度明显的轻于模型组，提示清肺化痰通络方可以减轻早期肺泡炎的改变，第14、28天干预组肺纤维化程度轻于同时段的模型组。提示清肺化痰通络方可以减轻模型动物的症状，并在肺组织结构上减轻和延缓纤维化的发生。

组织纤维化的发生是由于ECM代谢失衡，打破了脏器原有的组织结构，纤维结缔组织大量增生的结果[4]。ECM包括纤维性成分、连接蛋白和间质成分，主要为糖胺聚糖等，其对细胞增殖和分化发挥重要调控作用，合成和降解这些蛋白质的ECM代谢酶可分为基质金属蛋白酶类 （MMPs）和基质金属蛋白酶组织抑制物（TIMP）。MMPs的明胶酶（MMP-2、MMP-9）主要降解Ⅳ胶原纤维、纤维连接蛋白、肺基膜等成分，由于肺基膜及结构支架的损伤与肺纤维化密切相关，因此，MMPs在肺纤维化发生中的作用日益受到重视[5]。有报道MMP抑制剂巴马司他等能降低MMP-9活性，抑制TNF-α和TGF-β1释放，减轻动物模型的肺纤维化[6-7]。Lemjabbar等[8]测定了肺间质纤维化患者支气管肺泡灌洗液中蛋白和MMP-2 mRNA的表达，显示激素及免疫抑制剂治疗可以降低肺内MMP-2表达。上述研究均表明损伤肺组织可能通过持续性高表达MMPs，使基膜不可逆性损伤断裂，阻碍新生上皮组织重构正常肺泡腔，最终导致肺纤维化。

本实验研究显示，第3天开始模型组和干预组肺内MMP-2、MMP-9的表达均开始增加，模型组和干预组MMP-9在第7天时已经达到高峰，然后干预组快速下降，到第28天时MMP-9水平基本接近正常，模型组在第7天出现MMP-9表达高峰，第14、28天也出现明显的下降，但是28天时MMP-9的水平仍高于对照组。肺纤维化大鼠在造模的第3~14天以肺泡炎的病理改变为主，提示MMP-9可能与早期上皮基底膜损伤有关，参与了细胞外基质和基底膜的降解。干预组的MMP-9明显下降，且在第14天时MMP-9的表达明显低于模型组，推测清肺化痰通络方可能是通过抑制MMP-9表达，从而延缓、减轻早期肺泡炎的发生。模型组和干预组MMP-2在第14天时达到高峰，然后缓慢下降，第28天时，模型组和干预组仍高于对照组。第14、28天时以肺纤维化为主要病变，提示MMP-2则可能在肺泡上皮细胞的再生与肺组织的异常修复中起重要作用。第14、28天MMP-2在干预组的表达低于模型组，且干预组肺纤维化程度比模型组轻，提示清肺化痰通络方通过延缓或者抑制MMP-2表达，达到延缓以及抑制肺纤维化的目的。

综上所述，本实验结果提示，BLMA5诱导的肺纤维化模型在不同时期MMPs的表达不同，早期病变肺组织以MMP-9的增加为主，晚期则以MMP-2增加为主，与有关报道一致[9]。清肺化痰通络方可能通过抑制MMP-9在肺纤维化大鼠肺内的表达，减轻早期的肺泡炎，抑制MMP-2的表达，延缓和抑制后期肺纤维化的发生。

[参考文献]

[1]陈佰义.博莱霉素致大鼠肺纤维化肺泡巨噬细胞氧化和抗氧化损伤的动态研究[J].中国医科大学学报，1995，24（3）：240.

[2]Szapiel SV，Elson NA，Fulmer JD. Bleomycin induced interstitial pulmonary disease in thende，athymice mouse [J]. Am Rev Respir Dis，1979，120：893.

[3]柴文戍，李永春，刘玉玲，等.博来霉素致肺纤维化大鼠形态学变化的实验研究[J].中国实验动物学报，2003，11（2）：77-80.

[4]卢韶华，王岫南，谭云山，等.基质金属蛋白酶与弥漫性肺间质纤维化[J].国外医学：呼吸系统分册，2004，24（z1）：31-34.

[5]朱礼星，钟南山，徐军，等.基质金属蛋白酶与肺纤维化[J].现代临床医学生物工程学杂志，2001，7（5）：382-385.

[6]Corbe MS，Caulet-Maugendre N，Germain S，et al. Inhibition of bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice by the matrix metalloproteinase inhibitor batimastat [J]. J Pathol，2001，193（4）：538-545.

[7]Underwood DC，Osborn RR，Bochnowicz S，et al. SB 239063，a p38 MAPK inhibitor，reduces neutrophilia，inflammatory cytokines，MMP-9，and fibrosis in lung [J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2000，279（5）：895-902.

[8]Lemjabbar H，Gosset P，Lechapt ZE，et al. Overexpression of alveolar macrophag elationaseB（MMP-9）in patients with idiopathic pulmonary fibrosis：effects of steroid and immuno suppressive treatment [J]. Am J Respir Cell Mol Biol，1999，20（5）：903-913.

[9]Oggionni T，Morbini P，Inghilleri S，et al. Time course of matrix metalloproteases and tissue inhibitors in bleomycin-induced pulmonary fibrosis [J]. Eur J Histochem，2006，50（24）：317-332.

（收稿日期：2012本文編辑：程铭）