模拟失重降低大鼠血清和下颌下腺Ghrelin水平

张金山 赵洁 李臻等

[摘要] 目的 观察模拟失重状态下大鼠血清和下颌下腺内Ghrelin表达的变化，为探讨航天失重环境下消化系统功能紊乱的机制提供实验依据。 方法 采用尾悬吊模拟失重模型，30只Sprague-Dawley大鼠随机分为4周悬吊组（n=15）和正常对照组（n = 15），用酶免疫分析（EIA）法测定动物血清和下颌下腺组织中Ghrelin的浓度。 结果 与正常对照组比较，模拟失重组大鼠血清和下颌下腺组织中Ghrelin水平均显著降低[（7.14±1.65）μg/L vs （5.72±1.42）μg/L，P < 0.05；（8.36±1.87）μg/gvs （6.45±2.06）μg/g，P<0.01）]。 结论 模拟失重环境可致大鼠血清和下颌下腺组织中Ghrelin水平下降，Ghrelin可能参与模拟失重环境下消化系统功能紊乱的调节。

[关键词] 模拟失重；Ghrelin；血清；下颌下腺；大鼠

[中图分类号] R576.06[文献标识码] A[文章编号] 1673-7210（2012）05（c）-0029-03

失重导致的宇航员厌食和体重下降是当前航天医学研究的重要领域之一。航天性厌食症表现为航天飞行过程中出现热量摄入减少和体重下降，严重影响航天员的耐力和执行力[1]。失重导致航天员消化道功能紊乱（如厌食症和体重下降）的机制仍不完全清楚。摄食相关激素与食欲和维持机体的能量稳态密切相关，目前已知与航天性厌食和体重下降有关的摄食相关激素包括神经肽Y（neuropeptide Y，NPY）、5-羟色胺（serotonin，5-HT）、促皮质激素释放素（corticotropin-releasing factor，CRF）和瘦素等[2-4]。Ghrelin是生长激素促分泌剂受体（GHS-R）的内源性配体，可刺激食欲及摄食，调节机体能量平衡，促进胃动力和胃酸分泌，促进生长激素释放、抗炎癥及调节免疫反应等功能[5-6]。最近的研究表明，人和哺乳类动物唾液腺可合成和分泌Ghrelin，唾液中亦检出Ghrelin蛋白[7-9]。志愿者头低位倾斜卧床模拟失重模型中，唾液中应激因子（α-淀粉酶、皮质酮、CgA和β-内啡肽）水平明显升高，提示模拟失重可导致唾液腺分泌功能的变化[10]。为探讨Ghrelin在航天所致消化系统功能紊乱中的作用及其机制，本研究采用尾悬吊大鼠模型，观察模拟失重大鼠血清和下颌下腺组织中Ghrelin水平的变化，为深入研究航天失重所致消化功能紊乱的机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

健康雄性Sprague-Dawley大鼠30只（第四军医大学训练部实验动物中心提供），体质量180～200 g，动物饲养与实验过程均遵守本校实验动物饲养与使用的规定。

大鼠血清Ghrelin检测EIA试剂盒购自ADL（Adlitteram Diagnostic Laboratories）公司。

1.2 方法

1.2.1 模拟失重大鼠模型按随机原则将大鼠分为模拟失重组（n=15）和正常对照组（n=15）。采用-30°尾悬吊模拟失重动物模型，每只笼内悬吊一只大鼠，尾部悬于笼顶，使鼠前肢踏于笼底的塑料棒上，后肢悬空，身体纵轴与水平面成30°；正常对照组除不悬吊外，其他条件与模拟失重组相同，实验期间两组大鼠均可自由摄食和饮水。

1.2.2 大鼠血清和下颌下腺组织制备尾悬吊模拟失重4周结束后，将两组大鼠在乌拉坦（1.2 g/kg体重）腹腔注射麻醉下，剖开胸腔，暴露心脏，用一次性注射器左心室内取血3 mL于4℃静置2 h，4 000 r/min离心15 min取上清液，置-70℃保存备用。然后做颈部切口，分离下颌下腺组织，称重，用2 mL匀浆器匀浆（加1 mL PBS），组织匀浆液用样品稀释液稀释5倍。-70℃保存，留待EIA检测。

1.2.3 大鼠血清和下颌下腺组织中Ghrelin水平检测应用酶免疫分析（enzyme immunoassay，EIA）方法检测悬吊和正常对照大鼠血清中和下颌下腺组织中Ghrelin水平。EIA检测的具体操作步骤按试剂盒说明书进行，主要程序如下：①于空白微孔内依次滴加标准品、血清或组织匀浆样品100 μL；②于标准品或样品孔中加入酶标记液50 μL；③37℃孵育反应60 min；④洗板机清洗5次，每次静置20 s；⑤在标准品或样品孔中加入底物A、B液各50 μL；⑥37℃下避光孵育反应15 min；⑦每孔内加入终止液50 μL，终止反应；⑧轻轻混匀，30 min内用酶标仪检测各孔的A值（450 nm滤色片）。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

尾悬吊模拟失重组与正常对照组大鼠血清和下颌下腺组织中Ghrelin水平的EIA检测结果见表1。与正常对照组比较，模拟失重大鼠血清和下颌下腺组织中Ghrelin水平均显著低于正常对照组（P<0.05或P<0.01）。

3 讨论

失重是航天过程中重要的环境因子，可引起机体多种器官系统的生理功能改变，因而对失重状态下宇航员身体各器官系统变化的研究日益受到重视。长期处于失重环境中，航天人员易出现食欲下降、腹胀和消化不良等胃肠功能紊乱症状，并导致摄食减少和体重下降。目前已有一些针对失重状态下胃肠功能变化的研究，如模拟失重状态可造成肠道菌群失调；血循环和胃肠黏膜中神经肽和胃肠激素（生长抑素、胃动素、5-HT、CRF、NPY/AgRP和瘦素等）水平改变；小肠黏膜微绒毛和绒毛表面积减少且排列紊乱；肠系膜动脉血管收缩，导致小肠血供减少等。Ghrelin是迄今发现的唯一一种GHS-R内源性配体，循环中的Ghrelin主要由胃X/A样细胞产生，有酰基化和去酰基化两种存在形式。血循环中酰基化的Ghrelin只占很少的一部分，其酰基化过程由Ghrelin酰基转移酶（Ghrelin O-Acyltransferase，GOAT）完成。酰基化Ghrelin通过GHS-R1a型受体发挥作用，GHS-R1a广泛分布于人体多种组织，如下丘脑、垂体、海马、大脑皮质、胃肠胰系统、肾、心肌、肾上腺、肺、卵巢和肌肉等。由此可见，Ghrelin在消化、神经、内分泌、心血管、生殖及免疫系统均可能发挥生物学功能[6]。

本研究结果表明，4周尾悬吊模拟失重大鼠血清和下颌下腺组织中Ghrelin水平均显著下降，说明模拟失重可引起体内Ghrelin生成和分泌活动减弱，由于Ghrelin可刺激食欲和促进摄食行为，这一研究结果可部分解释航天失重时出现的食欲下降和厌食。下颌下腺可合成和分泌多种生物活性物质，参与机体的多种生理反应。Rai等[10]对12例男性志愿者所作的-6°头低位卧床21 d模拟失重模型的研究发现，卧床1周后受试者出现心理应激反应，唾液中应激性激素CgA、皮质醇、α-淀粉酶和β-内啡肽水平较卧床前显著升高，并在随后的2周卧床期间继续缓慢升高。唾液腺组织中Ghrelin的定位研究多来自人的材料，Aydin等[8]首先比较了青年健康人群血浆和唾液中Ghrelin水平，发现唾液中Ghrelin水平显著高于血浆，免疫组化染色显示唾液腺导管上皮细胞呈Ghrelin免疫反应阳性。随后的研究表明[7，9]，唾液腺可合成与分泌Ghrelin，Ghrelin-mRNA表达于人腮腺和下颌下腺、而舌下腺内未检出Ghrelin-mRNA；Ghrelin蛋白广泛表达于腮腺和下颌下腺纹状管、闰管、分泌管和浆液性腺泡细胞的胞浆，但舌下腺的黏液性腺泡细胞无Ghrelin蛋白表达。腮腺和下颌下腺的合成与释放是唾液中Ghrelin的主要来源。

多种疾病时可出现唾液和血浆Ghrelin的波动。肥胖型2型糖尿病患者唾液中Ghrelin水平显著下降；胃癌和唾液腺黏液表皮癌组织中Ghrelin表达亦明显降低；癫痫患者治疗前血清和唾液腺Ghrelin水平显著低于正常对照；病理性肥胖和正常人群空腹唾液Ghrelin水平显著高于血清，病理性肥胖人群标准餐后血清Ghrelin水平无明显受抑制，而唾液中Ghrelin水平却显著下降[11-14]。

有关Ghrelin在唾液腺表达的功能研究证明，Ghrelin可促进口腔黏膜上皮细胞增殖，并且这种作用可被Ghrelin特异性抑制剂NOX-B11阻断[9]。Ohta等[15]观察Ghrelin对TNF-α或LPS刺激下口腔上皮细胞IL-8分泌的影响。发现Ghrelin可增加口腔上皮细胞内钙动员和cAMP水平；合成的Ghrelin抑制TNF-α或LPS刺激下口腔上皮细胞IL-8的合成与分泌，提示Ghrelin可对炎性感染的固有免疫反应起调节作用。Ghrelin抗LPS-诱导的腺泡细胞凋亡活动与cNOS活性增强、iNOS和Caspase-3表达下降有关，Ghrelin参与SrC/Akt-介导的cNOS活化和NO-诱导的Caspase-3 S-亚硝基化凋亡信号途径[16]。

本研究通过对模拟失重状态下大鼠血清和下颌下腺Ghrelin表达的检测，证明了Ghrelin可能在航天失重环境下机体内分泌和代謝紊乱中发挥重要作用。进一步探讨失重条件下Ghrelin与其他摄食相关激素之间的相互作用，将有助于阐明失重引起胃肠功能紊乱的机制，为完善载人航天医务保障提供理论支持。

[参考文献]

[1]Dasilva MS，Zimmerman PM，Meguid MM，et al. Anorexia in space and possible etiologies： an overview [J]. Nutrition，2002，18（10）：805-813.

[2]Baek K，Barlow AA，Allen MR，et al. Food restriction and simulated microgravity： effects on bone and serum leptin [J]. J Appl Physiol，2008，104：1086-1093.

[3]Mano T，Nishimura N，Iwase S. Sympathetic neural influence on bone metabolism in microgravity [J]. Acta Physiologica Hungarrica，2010，97（4）：354-361.

[4]Wang KX，Shi Y，Denhardt DT. Osteopontin regulates hindlimb-unloading-induced lymphoid organ atrophy and weight loss by modulating corticosteroid production [J]. PNAS，2007，104（37）：14777-14782.

[5]Kojima M，Hosoda H，Date Y，et al. Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach [J]. Nature，1999，402：656-660.

[6]Stengel A，Taché Y. Ghrelin-a pleiotropic hormone secreted from endocrine x/a-like cells of the stomach [J]. Front Neurosci，2012，6：24.

[7]Gr■schl M，Topf HG，Bohlender J，et al. Identification of ghrelin in human saliva： production by the salivary glands and potential role in proliferation of oral keratinocytes [J]. Clin Chem，2005，51（6）：997-1006.

[8]Aydin S，Halifeoglu I，Ozercan IH，et al. A comparison of leptin and ghrelin levels in plasma and saliva of young healthy subjects [J]. Peptides，2005，26（4）：647-652.

[9]Li BB， Chen ZB， Li BC，et al. Expression of ghrelin in human salivary glands and its levels in saliva and serum in Chinese obese children and adolescents [J]. Arch Oral Biol，2011，56（4）：389-394.

[10]Rai B，Kaur J. Salivary stress markers and psychological stress in simulated microgravity：21 days in 60 head-down tilt [J]. J Oral Sci，2011，53（1）：103-107.

[11]Aydin S. A comparison of ghrelin，glucose，alpha-amylase and protein levels in saliva from diabetics [J]. J Biochem Mol Biol，2007，40（1）：29-35.

[12]Aydin S，Ozercan IH，Dagli F，et al. Ghrelin immunohistochemistry of gastric adenocarcinoma and mucoepidermoid carcinoma of salivary gland [J]. Biotech Histochem，2005，80（3-4）：163-168.

[13]Aydin S，Dag E，Ozkan Y，et al. Nesfatin-1 and ghrelin levels in serum and saliva of epileptic patients： hormonal changes can have a major effect on seizure disorders [J]. Mol Cell Biochem，2009，328（1-2）：49-56.

[14]Benedix F，Westphal S，Patschke R，et al. Comparison of serum and salivary ghrelin in healthy adults， morbidly obese，and patients with metastatic carcinoma [J]. Obes Surg，2011，21（8）：1265-1271.

[15]Ohta K，Laborde NJ，Kajiya M，et al. Expression and possible immune-regulatory function of ghrelin in oral epithelium [J]. J Dent Res，2011，90（11）：1286-1292.

[16]Slomiany BL，Slomiany A. Constitutive nitric oxide synthase-mediated caspase-3 S-nitrosylation in ghrelin protection against Porphyromonas gingivalis-induced salivary gland acinar cell apoptosis [J]. Inflammopharmacology，2010，18（3）：119-125.

（收稿日期：2012-03-19本文編辑：卫 轲）