miR-155反义寡核苷酸转染对人大肠癌Lovo细胞侵袭的影响

毛镇伟 朱灵 范钰

miR-155反义寡核苷酸转染对人大肠癌Lovo细胞侵袭的影响

毛镇伟 朱灵 范钰

目的探讨miR-155对人大肠癌细胞侵袭能力的影响。方法 大肠癌Lovo细胞分为3组:脂质体介导反义miR-155(AS-miR-155)组、无义寡脱氧核苷酸(ODN)组和对照组。测定荧光素酶活性验证3组细胞中miR-155的表达，采用Matrigel基质生长试验检测细胞生长情况，以Transwell方法检测细胞的侵袭力，结果 与对照组和无义ODN组比较，转染AS-miR-155组Lovo细胞miR-2l表达水平降低;Matrigel基质生长试验显示，转染AS-miR-155组Lovo细胞体外培养克隆平均直径较小，Transwell细胞侵袭试验显示转染AS-miR-155组穿膜细胞数较少。结论miR-2l高表达可促进Lovo大肠癌细胞侵袭生长，提示miR-155可以作为基因治疗大肠癌的候选靶点。

大肠癌;miR-155;侵袭

许多学者发现，microRNAs的异常表达与多种人类癌症的发生密切相关［1］。研究发现miR-155在免疫、肿瘤等疾病生理或病理过程中起着重要的调控作用［2，3］。最近，有学者发现，miR-155在乳腺癌、大肠癌等多种实体瘤组织或细胞中高表达［4，5］，但目前尚不清楚miR-155在大肠癌细胞侵袭中的作用;本课题组采用寡核苷酸敲低miR-155的表达，观察了对人大肠癌Lovo细胞生长侵袭的影响。

1 实验方法

1.1 反义寡脱氧核苷酸(antisense oligodeoxyribonucleotides，AS)转染 大肠癌Lovo细胞在DMEM完全培养液中37℃，5%CO2常规条件下培养。根据文献［6］方法设计合成寡脱氧核苷酸序列，转染按照试剂说明书操作，空白对照组加入等体积PBS。

1.2 荧光素酶活性检测 将对数生长期Lovo细胞消化接种于96孔板，4×103个细胞/孔;培养12 h后进行实验分组和处理，方法同上。转染24 h后，弃培养基，使用细胞裂解缓冲液充分裂解细胞20 min，加入发光底物20 μL，孵育10 min后使用ELX800酶标仪测定荧光素酶活性。

1.3 Matrige基质生长试验 具体步骤参照文献［7］方法进行。连续观察15 d，应用相差倒置显微镜记录结果。

1.4 Transwell细胞体外侵袭试验 该试验在Transwell板上进行，具体步骤参照文献［7］方法，于倒置显微镜观察穿过膜细胞数。

1.5 统计学方法 用SPSS 12.0统计软件进行分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 miR-155表达水平 结果显示:对照组、无义ODN和AS-miR-155组Lovo细胞荧光强度明显不同，差异有统计学意义。而两两比较显示转染AS-miR-155组Lovo细胞荧光强度高于对照组和无义ODN组，差异有统计学意义(P＜0.05)。说明转染AS-miR-155可有效下调Lovo细胞中miR-155表达。

2.2 Matrigel基质生长试验 结果发现，对照组和无义ODN组Lovo细胞克隆平均直径分别为(51.28±6.12)μm和(49.35±6.33)μm，转染AS-miR-155组 Lovo细胞的平均直径为(28.26±5.38)μm，转染AS-miR-155组平均直径小于对照组和无义ODN组，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.3 Transwell细胞体外侵袭试验 结果发现，对照组和无义ODN组平均每个视野穿膜细胞数为(70.36±2.8)和(69.2±2.4)，而转染As-miR-155组穿膜细胞数为(33.5±2.2)，AS-miR-155组穿膜细胞数小于对照组和无义ODN组，差异有统计学意义(P＜0.05)。

3 讨论

MicroRNAs是一类短序列、非编码、具有调控功能的长约20 nt-24 nt单链小分子RNA。大量证据表明microRNAs的异常表达与多种人类癌症的发生密切相关［1］。MicroRNAs的发现和应用，为恶性肿瘤的诊断和治疗提供了新的靶点。

癌细胞侵袭转移是大肠癌治疗失败的主要原因之一，积极寻找与大肠癌侵袭转移的分子标志物、探讨其分子机制，无疑会有助于大肠癌的综合诊疗水平。研究表明，miR-155过表达和多种上皮系统来源恶性肿瘤如乳腺癌、大肠癌的发生及其恶性生物学表型密切相关［4，5］。但目前尚不清楚其在大肠癌细胞侵袭中的作用。本课题组采用反义寡核苷酸敲低miR-155的表达后，发现，与空白对照组和无义ODN组比较，miR-155表达下调后Lovo细胞在Matrigel胶上生长形成克隆的能力降低;且穿过Transwell小室聚碳酸酯膜的能力下降。由此提示，miR-155过表达在大肠癌细胞向周同正常组织的侵袭过程中起重要作用。

本研究说明，miR-155具有正调控大肠癌细胞侵袭性生长作用，是大肠癌基因治疗中的一个颇具前景的候选靶点。

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［5］ Bakirtzi K，Hatziapostolou M，Karagiannides I，et al.Neurotensin signaling activates microRNAs-21 and-155 and Akt，promotes tumor growth in mice，and is increased in human colon tumors.Gastroenterology，2011，141(5):1749-1761．

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Effects of miRNA-155 on invasion of human corectal cancer cell

MAO Zhen-wei，ZHU Ling，FAN Yu.

Cancer Institute，Affiliated People's Hospital of Jiangsu University，Jiangsu 212002，China

Objective To study the effects of miR-155 on invasion of human colon cells.Methods After human colon cancer Lovo cell were transfected by miR-155 antisense miRNA-155(AS-miR-155).The miR-155 knocking down effects was examined by luciferase reporter assay.Matrigel cell growth assay and Transwell assay were used to determine the growth and invasion abilities of cancer cells.Results Luciferase intensity in As-miR-155 treated Lovo cells was significantly suppressed as compared with that in the control groups(P＜0.05).The diameter of cultured clone in As-miR-155 treated Lovo cells was smaller than that in the control groups.Decreased cells via the transwell member in the AS-miR-155 treatment group were detected as compared with those in the control groups.Conclusion

Over-expression of miR-155 induce the growth and invasion abilitiesof human colon cancer cell．

Colorectal cancer;miR-155;Invasion

江苏省自然科学基金(项目编号:BK2009205);镇江市科技计划项目(项目编号:SH2009014)

212002 镇江，江苏大学附属人民医院肿瘤研究所

范钰