微型化DNS法测定多糖水解液中还原糖的质量浓度

邵锦挺，应国清，王 琦，梅建凤，王 鸿，易 喻

（1.浙江工业大学 药学院，浙江 杭州310032；2.加拿大农业与农业食品部圭尔夫食品研究中心，加拿大 圭尔夫N1G5C9）

3，5－二硝基水杨酸（DNS）比色法是还原糖测定的一种常用的经典方法，广泛应用于各种糖类测定实验［1－2］.有关该方法的研究改进主要集中在考察试剂添加量、显色时间、检测波长等因素对测定结果的影响［3］.但传统DNS法仍然存在一些缺陷，比如对微量样品检测难以进行，对大批量的样品检测又显得操作繁琐，故有必要将传统DNS法进行微型化.酶联免疫测试仪（酶标仪）是近年来实验室中逐渐普及的检测仪器之一，目前主要应用于酶联免疫检测（ELISA），其工作原理与分光光度计相同都是依据朗伯－比尔定律［4］，但其一次性检查样品可达96个，是分光光度计一次性可检查样品数量的几十倍，因此采用酶标仪代替分光光度计分析能有效提高检测效率，故将传统DNS法进行改进并建立微型化DNS法，采用酶标仪检测吸光度测定还原糖含量以达到检测简便、快速和样品用量少等目的.

1 材料与方法

1.1 试 剂

标准品葡萄糖、3，5－二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、亚硫酸钠、氢氧化钠、盐酸、苯酚等试剂均为市售分析纯.

1.2 仪 器

主要仪器紫外可见分光光度计（上海尤尼柯公司，UV－2000型）、酶标仪（美国分子仪器有限公司，Spectramax M2型）.

1.3 DNS试剂配制

称取185g酒石酸钾钠溶于500mL蒸馏水，加热至45℃，再加入6.3g的3，5－二硝基水杨酸和262mL氢氧化钠（2mol／L）溶液，溶解后加入5g苯酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解.冷却后加蒸馏水定容至1 000mL，贮存于棕色瓶中暗处保存7d备用［5］.

1.4 还原糖的测定

1.4.1 传统DNS分光光度法

精确称取0.100g葡萄糖，蒸馏水溶解并定容至100mL.分别取上述葡萄糖标准溶液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mL于相应编号具塞试管中，再分别加入蒸馏水1.0，0.9，0.8，0.7，0.6，0.5mL，再各加DNS试剂1mL，混匀后于沸水浴中加热5min，流水冷却后分别向各试管中加入8mL蒸馏水，混匀，以0号管为空白对照，用紫外可见分光光度计测定各管溶液波长为540nm下吸光度.以葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光度（A540）为纵坐标绘制标准曲线.

1.4.2 微型化DNS法

精确称取0.100g的葡萄糖，蒸馏水溶解并定容至100mL.取上述葡萄糖标准溶液分别20，40，60，80，100μL于相应编号的1.5mL的塑料离心管中，再分别加入蒸馏水80，60，40，20，0μL，再各加DNS试剂100μL，混匀后于沸水浴中加热5min，流水冷却后分别向各试管中加入800μL蒸馏水，混匀，每管移取200μL于96孔板中，用酶标仪检测各管540nm波长下的吸光度.以葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光度（A540）为纵坐标绘制标准曲线.

2 结果与分析

2.1 DNS标准曲线

如方法1.4所述，分别绘制传统DNS法和微型化DNS法标准曲线.以葡萄糖质量浓度为横坐标，A540为纵坐标，绘制的标准曲线见图1.由图1可见，微型化DNS法标准曲线显示，葡萄糖质量浓度在0.2～1.0mg／mL围内，与A540的线性关系良好，得到回归方程A＝0.890 5C－0.022 7，R2＝0.999 4，检出限为0.028mg／mL.由标准曲线的斜率可以看出，微型化DNS法的灵敏度不如传统DNS法，但能满足实验测定的需要.

图1 葡萄糖质量浓度—A540的标准曲线Fig.1 Specification curve for calculating glucose mass concentration by A540

2.2 重复性实验

将一定量琼脂加入到0.4mol／L盐酸中，于60℃水浴中水解4h，反应完后取出并加入氢氧化钠中和至中性，冷却后经8 000r／min离心5min后得上清液为琼脂多糖水解液样品.用微型化DNS法检测吸光度，用2.1中得出的标准曲线计算样品中还原糖质量浓度，重复测定5次，结果见表1，计算得RSD为1.36%，表明微型化DNS法有较好的精密度.

表1 重复性实验数据Table 1 Date of duplicated experiment

2.3 加样回收率实验

用微型化DNS法测定2.2中的琼脂多糖水解液中的还原糖含量，再分别添加葡萄糖标准品溶液，使样品中的葡萄糖的添加质量浓度分别为0.2，0.3，0.4，0.5mg／mL，微型化 DNS法测定样品中还原糖的总质量浓度，结果见表2.计算回收率和RSD，两者分别为100.6%和1.74%.表明微型化DNS法精确性较好.

表2 回收率实验数据Table 2 Date of returns－ratio experiment

2.4 传统DNS法和微型化DNS法检测样品的比较

取葡萄糖水溶液5份和琼脂多糖水解液样品5份，分别以传统DNS法和微型化DNS法测定还原糖质量浓度.对两种分析方法测定结果进行t检验，比较差异情况.考察两种方法检测差异情况，其中样品的测定结果见表3.两种分析方法测定含葡萄糖样品和多糖水解液样品结果分别进行t检验，P值分别为0.114 0和0.118 1（＞0.05），说明两种方法测定结果无显著差异.

表3 还原糖质量浓度Table 3 Reducing sugar mass concentration mg／mL

3 结 论

采用酶标仪为检测工具建立的微型化DNS法，其检测还原糖含量的标准曲线回归方程为A＝0.890 5C－0.022 7，R2＝0.999 4，线性范围为0.2～1.0mg／mL.样 品 加 样 回 收 率 为 99.0% ～103.0%，重现性好，RSD为1.74%.比较传统DNS法与微型化DNS法测定样品，对测定结果进行t检验，P＝0.118 1（＞0.05）表明两种方法检测到结果无明显差异，证实微型化DNS法是切实可行的.由于酶标仪对样品进行检测效率是分光光度计检测效率的几十倍，微型化DNS法检测所需样品量为传统DNS法的十分之一甚至更少，故微型化DNS法有望切实提高批量样品还原糖含量的检测效率以及对微量样品进行检测.

［1］夏春森，韦史利，钟艳红.3，5－二硝基水杨酸比色法测定黄芪多糖的含量［J］.中国民族民间医药，2009（8）：13－14.

［2］孙小丁，姜守刚，杨丽新.DNS法测定谷氨酸发酵过程中总糖的研究［J］.发酵科技通讯，2009，38（3）：22－25.

［3］赵凯，许鹏举，谷广烨.3，5－二硝基水杨酸比色法测定还原糖含量的研究［J］.食品科学，2008，29（8）：534－536.

［4］李明兆，卢瑞祥.酶标仪性能评价和校准方法的探讨［J］.中国测试技术，2005，31（4）：100－101.

［5］张波.生物化学与分子生物学实验教程［M］.北京：人民军医出版社，2009.