一种适于ISSR分析的太子参DNA提取方法

王晓多 王晓理

[摘要]目的 获得能用于中药太子参简单序列重复区间DNA标记技术等分析研究的高质量DNA。 方法 以太子参为材料，采用改良CTAB法提取太子参DNA，经紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测。 结果 改良的CTAB法能获得高质量的太子参DNA，OD260/OD280＞1.8，蛋白质、多糖、RNA等去除较彻底，适于简单序列重复区间分析。 结论 改良的CTAB法所提取太子参DNA适于简单序列重复区间分析。

[关键词] 太子参；DNA；OD值

[中图分类号] R284.2???[文献标识码] B???[文章编号] 2095-0616（2012）15-56-02

An extraction method of genome DNA from Pseudostellaria heterophylla（Miq.）Pax ex Pax et Hoffm. scape for ISSR analysis

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1.Huaxi Agricultural Bureau of Guiyang City, Guiyang 550025,China;2.Wudang Agricultural Technique Service Center of Guiyang City,Guiyang 550018,China

[Abstract] Objective To extract high quality DNA from Pseudostellaria heterophylla(Miq.)Pax ex Pax et Hoffm.for ISSR and other molecular biological analysis. Methods It was examined with ultraviolet spectrophotometer and agarose electrophoresis that the DNA was extractied by improved CTAB. Results The improved CTAB method was used to extract DNA. The purity of the extracted DNA was very high with OD260/OD280 values ＞1.8.The protein,polyhexose and RNAwere elminated completely. Conclusion The improved CTAB method was suitable for extracting DNA from Pseudostellaria heterophylla（Miq.）Pax ex Pax et Hoffm.for ISSR analysis.

[Key words] Pseudostellaria heterophylla（Miq.）Pax ex Pax et Hoffm.;DNA;OD value

简单序列重复区间（ISSR）分子标记技术具有多态性高，可重复性和稳定性好的特点[1]。为了构建太子参[Pseudostellaria heterophylla（Miq.）Pax ex Pax et Hoffm.]ISSR分子标记，首先，必须从太子参中提取到高质量的DNA。本试验以新鲜太子参为材料，避免DNA分子的降解，采用改良CTAB法提取太子参基因组DNA，能够除去多糖及酚类杂质，获得纯度和产率可以用于ISSR分析的DNA。

1?材料与方法

1.1?供试材料

太子参（PseudosteUaria heterophylla）新鲜块根，由贵阳医学院生药研究室采集并鉴定。

1.2?试剂试液

CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），SDS（十二烷基磺酸钠），琼脂糖，溴化乙锭（EB），RNase；CTAB提取缓冲液（2 g/100 mL CTAB，1.4 mol/L NaC1，20 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris·C1，pH 8.0）

1.3?主要仪器

低温高速离心机（Beckman GS）；紫外/可见分光光度计（上海分析仪器厂）；凝胶成像仪（UVPGDS7600G）；稳压稳流电泳仪（北京六一仪器厂DYY28B型）。

2?方法

2.1?太子参基因组DNA的提取采用改进的CTAB法[2]

（1）取供试材料，用重蒸水洗净，加入液氮迅速研磨成粉末。将粉末移至1.5 mL的离心管中，加入700μL己预热（65℃）的CTAB裂解缓冲液，混匀后置于65℃水浴1.5 h，期间轻摇几次。

（2）水浴完成后，冷至室温，加入等体积氯仿/异戊醇（24︰1，V/V），反复颠倒数次混合，13 000 r/min，离心10 min。取上清液转至另一离心管中，再加入等体积氯仿/异戊醇（24︰1，V/V），轻轻混匀，13 000 r/min，离心10 min，上清加2/3倍体积异丙醇（预冷），混匀，可见絮状DNA。

（3）于-20℃冰箱冷冻1 h后取出，13 000 r/min，离心5 min。弃上清，沉淀加入70%乙醇，洗涤2～3次。室温风干后，加入30～60μL TE溶液（pH 8.0），溶解DNA，加适量RNA酶，置37℃水浴半小时，加等体积氯仿/异戊醇（24︰1，V/V），反复颠倒数次后于13 000 r/min，离心10 min。吸取上清液于另一离心管中，加入1/10体积的3M醋酸钠溶液（pH 5.2），混匀。再加入2倍体积预冷的无水乙醇。轻轻颠倒几次，在冰块上放置10 min至絮状DNA出现。10 000 r/min，离心5 min。弃上清，沉淀加入70%乙醇，洗涤2～3次。室温风干后，加入适量TE溶液（pH 8.0）溶解，4℃下保存。

2.2?检测

采用0.8%琼脂糖凝胶铺板，电泳2 h，于装有EB液的凝胶成像系统中摄像。

2.3?DNA产率和纯度测定

取1μLDNA提取液，加1×TE稀释50倍，用核酸蛋白仪，测定在波长260 nm 和280 nm处的吸收值，根据OD260/OD280判断DNA纯度，OD260值计算DNA提取率。

提取率=OD260×50μg×稀释倍数（本研究中稀释倍数为50）；DNA纯度=OD260/OD280。

3?结果

提取的太子参DNA，电泳检测点样孔无残留，条带清晰明亮，无拖尾，分子量大约630 bp，说明太子参DNA无降解，并且RNA、蛋白质、多糖等去除较干净，DNA纯度较高。见图1。通过核酸蛋白仪测定，DNA浓度＞30 mg/g，OD260/OD280值＞1.8，能够进行ISSR分析。稀释倍数为25；提取率按OD260×50μg×稀释倍数（25）计算，DNA纯度按OD260/OD280比值判断。结果：DNA浓度＞30 mg/g，纯度＞1.8。见表1。

3?讨论

由于太子参药材，均为产地加工后，经干燥，运输、贮藏等环节，其DNA难免会有降解，且在块根中含有的大量糖类、蛋白质、酚类化合物等杂质含量相对增高，提取的DNA常常和多糖、酚类形成共沉淀而较难分离纯化，较难保证DNA的提取产量和纯度；相反，本试验采用从太子参新鲜根能获得率高、纯度好的DNA。

因新鲜太子参的采集受季节限制，因赶时间做太子参ISSR标记研究，本实验的材料为当年新鲜出土的太子参块根，如条件和时间允许，采集太子参新鲜幼嫩的叶等作为其DNA提取的材料，高质量的DNA更易获得，因新鲜幼嫩的叶等，除了DNA未降解外，糖类、蛋白质、酚类化合物等杂质含量很少。

植物DNA提取的方法的选择和改良，应根据不同的植物材料或同一植物的不同部位进行选用[3]。本试验以新鲜太子参为材料，采用改良CTAB的适宜方法，提取太子参基因组总DNA，采用氯仿/异戊醇（24∶1，V/V）反复沉淀，和超过12 000 r/min较长时间及多次离心、等步骤，提取到了太子参片段较完整的基因组，并且RNA、多糖、蛋白质、酚类化合物等杂质去除较干净，DNA含量、纯度较高，可用于ISSR分析[4]。

[参考文献]

[1] 杜金昆，姚颖垠，倪中福，等.普通小麦、斯卑尔脱小麦、密穗小麦和轮回选择后代材料ISSR分子标记遗传差异研究[J].遗传学报，2002，29（5）：445-452.

[2] Roh MS，Cheong EJ，Choi IY，et al.（2007）Characterization of wild Prunus yedoensis analyzed by intersimple sequence repeat and chloroplast DNA[J].Scientia Horticulturae，114：121-128.

[3] 李晓波，冯波，张朝晖，等.植物药材总DNA提取[J].中草药，2002，33（7）：652-654.

[4] Mizukami H，Okabe Y.A simple ang rapid protocol for preparation of crude drug DNA suitable forPCR.Biol[J].Pharm Bul，1999（22）：765-766.

（收稿日期：2012-05-17）