酶解法提取海南龙血树叶总皂苷的工艺研究

杨 力，贾桂云

（海南师范大学 化学与化工学院，海南 海口 571158）

海南龙血树（Dracaena cambodiana pierre ex Gagnep）又名小花龙血树，龙舌兰科（Agavaceae），龙血树属（Dracaena）.分布于海南省西南部，国家二级保护濒危种.海南龙血树叶中含有甾体皂苷[1].甾体皂苷主要分布菝契科、玄参科、薯蓣科、百合科、龙舌兰科等单子叶植物中，甾体皂苷有极高的药用价值,具有有抗菌、抗炎、抗真菌、抗细胞毒性等作用，临床用于心脑血管疾病的防治；皂苷经体外试验显示具有较强的抑制ADP诱导的家兔血小板聚集作用[2-4].

根据甾体皂苷在无水条件下，遇某些酸类可产生与三萜皂苷相类似的颜色反应，故用五环三萜类的熊果酸标准品做标准对照品，选用显色灵敏的香草醛-高氯酸反应进行显色[5].

本研究采用酶解-乙醇浸提法[6]提取海南龙血树叶的总皂苷，为海南龙血树叶的皂苷的提取及药用研究提供依据.

1 仪器、材料与试剂

1.1 仪器

TU-1901双光束紫外分光光度计（北京普系通用仪器有限责任公司）；722紫外分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）；FZ-102型微型植物试样粉碎机（上海新诺仪器设备有限公司）；RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SB-5200DTD超声波清洗机（深圳富嘉达超声波设备）；TP-214电子天平（上海升隆电子科技有限公司）；

1.2 材料

海南龙血树叶采摘于海南师范大学桂林洋校区化学楼庭院内，洗净、阴干，剪成小片，40℃干燥后粉碎，做供试样品.

1.3 试剂

熊果酸对照品（含量≥98%上海顺勃生物工程有限公司），纤维素酶（北京奥科鼎盛生物科技有限公司），冰乙酸、无水乙醇、95%乙醇、香草醛、高氯酸等均为国产分析纯试剂.

2 实验方法与结果

2.1 海南龙血树叶总皂苷含量的测定方法

2.1.1 对照品溶液的制备

精密称取在105℃干燥至恒重的熊果酸对照品10.0 mg，用无水乙醇溶解、定容50 mL，配制成质量浓度200 μg/mL的熊果酸对照品溶液.

2.1.2 样品溶液的制备

精密称取海南龙血树叶粉1.0020 g至50 mL圆底烧瓶中，按料液比1∶10加水，调节pH=5.0，加入纤维素酶.使水解液中酶质量浓度为0.15 mg/mL，50℃水浴酶解2 h.然后80℃水浴灭活30 min，离心分离，沉淀转移到圆底烧瓶中，加入95%乙醇10 mL，在70℃下浸提1 h.将提取液与酶解液合并，抽滤.滤液65℃减压蒸干，用无水乙醇溶解并定容100 mL.

2.1.3 最大吸收波长的确定

分别吸取0.2 mL熊果酸对照品溶液和样品溶液于两支具塞试管中，80℃水浴挥干溶剂，加入0.2 mL新配制的5%的香草醛-冰乙酸，0.8 mL高氯酸溶液，在70℃水浴加热15 min，使其反应完全，取出流水冷却10 min，加入4 mL冰乙酸，摇匀.随行试剂作空白，在450～600 nm波长范围内进行波谱扫描，熊果酸标准溶液和样品溶液在545 nm出现最大吸收，故确定545 nm为最大吸收波长.

2.1.4 标准曲线的绘制

精密吸取熊果酸对照品溶液0.0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 mL置于具塞试管中，按3.1.3项下方法，在545 nm测吸光度.以吸光度为纵坐标，熊果酸的加入量为横坐标，绘制标准曲线（见图1）.

回归方程y=-0.0198+0.0101x，r=0.9993.方程在0～140 μg范围内有良好线性关系.

2.1.5 总皂苷含量的测定

准确吸取0.1 mL样品溶液于具塞试管中，按2.1.3项下方法测定.计算出海南龙血树叶总皂苷浓度及其总皂苷提取率.

图1 熊果酸标准曲线Fig.1 Standard curve of oleanolic acid

式中：C为样品溶液的总皂苷浓度（μg/mL）；V为样品溶液的总体积（mL）；W为所用龙血树叶粉的质量（μg）.

2.2 方法考查

2.2.1 显色液稳定性试验

准确吸取0.1 mL样品溶液，按2.1.3项下方法，每隔10 min测一次吸光度，计算相对标准偏差.结果见表1.

表1 稳定性试验Tab.1 Stability test

结果表明，显色时间在60 min内吸光度是稳定的，相对标准偏差RSD=0.41%（n=6）.因此在本实验测定时间范围内，皂苷和显色剂生成的有色化合物是稳定的.

2.2.2 精密度试验

准确吸取熊果酸对照品溶液6份，每份0.2 mL，按2.1项下的方法，测样品溶液吸光度，计算相对标准偏差.结果见表2.

计算RSD=1.57%（n=6），表明精密度良好.

2.2.3 加样回收率试验

分别吸取0.05，0.1，0.15，0.20，0.25 mL已知浓度的样品溶液，再加入0.1 mL熊果酸标准溶液，按2.1项下方法测定，计算回收率和相对标准偏差.结果见表3.

RSD=1.02%（n=5），平均回收率为100.40%，结果表明，本实验方法具有良好的回收率.

表2 精密度试验Tab.2 Precision test

表3 加样回收率试验Tab.3 Recovery test

2.3 海南龙血树叶总皂苷的提取工艺研究

采用酶解法,通过单因素试验和正交试验，考查酶质量浓度、酶解温度、pH值、酶解时间、料液比等因素对提取率的影响.

2.3.1 酶质量浓度对提取率的影响

精密称取海南龙血树粉5份，每份1.00 g，在pH=4.0，料液比为1∶10，酶解温度为50 ℃，酶质量浓度分别为 0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.15 mg/mL、0.2 mg/mL、0.25 mg/mL，水浴酶解1 h.结果见图2.

图2 酶质量浓度对提取率的影响Fig.2 Effects of concentration of cellulase

结果表明，随着酶质量浓度的增大，皂苷的提取率增大，在0.15 mg/mL时皂苷提取率达到最大，但随着酶质量浓度的继续增大，皂苷的提取率开始显著下降.

2.3.2 酶解温度对提取率的影响

精密称取海南龙血树粉5份，每份1.00 g，料液比为1∶10，pH=4.0，酶质量浓度为0.15 mg/mL，酶解时间1 h，分别在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃中水浴酶解.结果见图3.

图3 酶解温度对提取率的影响Fig.3 Effects of temperature of enzymatic hydrolysis on extraction rate

结果表明，总皂苷的提取率随着酶解温度的升高而升高，在50℃时总皂苷的提取率达到最大.继续升高酶解温度，总皂苷的提取率开始下降.因此，最佳酶解温度为50℃.

2.3.3 pH对提取率的影响

精密称取海南龙血树叶粉5份，每份1.00 g，在酶质量浓度为0.15 mg/mL，料液比为1∶10，酶解温度50 ℃，酶解时间为1 h，pH值分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，水浴酶解.结果见图4.

图4 pH对提取率的影响Fig.4 Effects of pH on extraction rate

结果表明，在pH=5.0时皂苷的提取率达到最大，在pH大于5.0，皂苷的提取率略有下降，故最佳pH值为5.0.

2.3.4 酶解时间对提取率的影响

精密称取海南龙血树叶粉5份，每份1.00 g，在pH=5.0，料液比1∶10，酶浓度为0.15 mg/mL，酶解温度50 ℃，酶解时间分别为0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h，水浴酶解.结果见图5.

图5 酶解时间对提取率的影响Fig.5 Effects of extracting time on extraction rate

结果表明，随着酶解时间的延长，总皂苷的提取率增大，酶解时间2.0 h提取率最高，而后增加缓慢，选择最佳酶解时间为2.0 h.

2.3.5 料液比对提取率的影响

精密称取海南龙血树叶粉5份，每份1.00 g，在pH=5.0，酶浓度为0.15 mg/mL，温度50℃，酶解时间为1.5 h，料液比分别为1∶5、1∶8、1∶10、1∶12、1∶15，水浴酶解.

结果表明，料液比1∶12时提取率最高，继续增加料液比，提取率变化趋于平缓.

2.3.6 正交试验优化工艺参数

为研究单因素对总皂苷提取率影响程度和交互作用，考查酶质量浓度、酶解温度、酶解液PH、酶解时间、料液比等5个因素，每个因素3个水平，采用L9（35）正交试验，确定最佳提取工艺.因素和水平见表4，试验结果见表5.

表4 因素水平表Tab.4 Actors and levels

结果表明，影响海南龙血树叶总皂苷提取率的因素中，影响程度为：C＞A＞B＞E＞D，即pH值＞酶质量浓度＞酶解温度＞料液比＞酶解时间.最佳提取工艺是A3B2C2D1E2，即酶质量浓度0.20 mg/mL，酶解温度50℃，pH=5.0，酶解时间为1.5 h，料液比分别为1∶12，为最佳提取工艺.在此条件下做验证试验，海南龙血树叶总皂苷的提取率最高为4.13%.

表5 正交试验结果Tab.5 Results of orthogonal test

3 结论

海南龙血树叶粉用纤维素酶进行酶解，减少了纤维素对皂苷提取的影响.用乙醇浸提，产物用紫外分光光度计进行比色分析，操作简便，显色灵敏度高，而且重现性较好.

海南龙血树叶的化学成分较复杂，目前尚没有关于海南龙血树叶成分的报道.本研究采用单因素及正交试验，筛选出了海南龙血树叶总皂苷的最佳提取工艺条件，为进一步研究开发海南龙血树叶的药用价值提供了依据.

[1]李成,宋启示.剑叶龙血树叶化学成分研究[J].中草药,2008,39(10)：1456-1458.

[2]董梅,吴立军,陈泉,等.黄山药中甾体皂苷的分离与鉴定[J].药学学报,2001,36(1)：42-45.

[3]杨学义,韩宝福,崔世贞,等.心脑舒通的药理和临床应用[J].中国新药与临床杂志,1992,11（6）：23-26.

[4]彭军鹏,吴雁,姚新生,等.薤白中两种新甾体皂苷成分[J].药学学报,1992,27(12)：918-912.

[5]李敏,费曜,李丽霞,等.天冬中总皂苷含量测定方法的探讨[J].成都中医药大学学报,2004,27(4)：46-48.

[6]张黎明,张小利.酶解-吸附澄清法提取山楂叶总黄酮的工艺研究[J].化学工程,2007,35（8）：49-52.