视紫红质和Peripherin/RDS基因在视网膜色素变性家系中的突变检测

章雪敏，刘铁城，金 鑫，张宝全，徐 华

1解放军总医院 眼科，北京 100853；2四川省宣汉县人民医院 眼科，达州 636150

原发性视网膜色素变性(retinitis pigmentosa，RP)是视网膜感光细胞和色素上皮细胞变性导致夜盲和进行性视野损害的遗传性致盲眼病。我国发病率约为1/3 784[1]。RP的遗传方式复杂多样，非综合征RP至少有4种遗传方式，其中15%-25%为常染色体显性遗传(adRP)，5%-20%为常染色体隐性遗传 (autosomal recessive RP，arRP)，5%-15%为X-连锁遗传(X-linked RP，XLRP)，另有5%早发型RP即隐性Leber's先天性黑蒙(LCAⅡ型)。当患者因缺乏家族史无法确定其遗传方式时，将其定义为散发型RP(sporadic RP，SRP)，约占40%-50%[2]。多数RP为单基因遗传，但也存在二基因－双等位基因和二基因－三等位基因遗传方式[3]。迄今为止，发现与RP有关的致病基因共59个，其中adRP 23个[4]。本研究对一个常染色体显性视网膜色素变性家系成员进行RHO、Peripherin/RDS、ROM1、NRL和CRX 5个常见候选基因检测，在分子水平阐述该家系的发病机制。

对象和方法

1 对象 本研究家系来自四川省达州市普光县，5代46名成员，已采集外周血的成员为28名，其中6名RP患者、1名疑似成员和21名正常成员。该家系RP性状连续3代传递，男女均可发病，发病比例为1∶5，符合常染色体完全显性遗传特征。

2 临床资料采集 按照RP诊断标准[5]询问家系成员病史，绘制家系图谱(图1)，确定疾病遗传类型，所有研究对象均行视力、眼压、房角、晶状体、眼底、视野及视网膜电图(electroretinography，ERG)等检查。分析家系的临床特点：患者年龄33-79岁，出现夜盲时间为5-15岁。视野损害出现时间各异，患者II：1、Ⅲ：1和Ⅳ：1无视野缩小病史。Ⅲ：1和Ⅲ：3出现红色觉减弱。Ⅲ：5和Ⅲ：7虹膜膨隆，房角为窄角Ⅲ-Ⅳ级，但眼压均正常。Ⅲ：1、Ⅲ：3、Ⅲ：5和Ⅲ：7出现并发性白内障。Ⅲ：1和Ⅲ：3玻璃体呈烟灰样混浊。除II：1外，所有患者黄斑区均出现骨细胞样色素沉着。疑似成员Ⅴ：1为11岁男性，父母诉其5岁出现夜盲，眼部检查未见异常。采集到血样的21名正常成员为Ⅲ：2、Ⅲ：4、Ⅲ：6、Ⅲ：9、Ⅳ：2-Ⅳ：6、Ⅳ：12、Ⅳ：13、Ⅳ：17、Ⅳ：18、Ⅴ：2-Ⅴ：9，眼底均未见异常。

3 外周血DNA制备 本研究通过解放军总医院伦理委员会论证，所有受检者签署知情同意书。抽取该家系中6名患者、1名疑似成员和21名正常成员外周静脉血8-10ml，EDTA抗凝。DNA抽提采用天根生化科技(北京)有限公司提供的离心柱型血液基因组DNA抽提试剂盒，按操作方法提取外周血白细胞DNA，-80℃保存待用。

4 PCR扩增 采用Primer3软件在线设计RHO、Peripherin/RDS、ROM1、NRL和CRX基因的 16个外显子及其与内含子交界处序列的引物[6-8]，引物由北京奥科生物技术公司合成。PCR反应在25μl体系中进行：2×Taq PCR MasterMix(含染料，蓝色)12.5μl，正反向引物各5μl(引物原液加灭菌ddH2O稀释50倍)，DNA模板2.5μl(模板原液)。反应条件：94℃ 3min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃1min，共30个循环，72℃延伸5min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭/紫外线鉴定，证实PCR扩增片段存在。

5 测序结果分析 将所得PCR产物送至北京中美泰和生物技术有限公司测序，所得结果使用Chromas软件、GeneTool软件和在线BLAST程序(http//www.ncbi.nlm.govBLAST)进行阅读和碱基序列比对。

结 果

该家系患者扩增产物在RHO、Peripherin/RDS、ROM1、NRL和CRX基因中未发现致病突变，但在Peripherin/RDS基因第1外显子(exon)和第3外显子编码区发现4处单核苷酸改变，属于单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)。在正常成员中，这些部位的氨基酸均和美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)数据库上公布的标准序列一致。如表1所示。相对应的峰图见图2。

表1 Peripherin/RDS基因测序结果Tab 1 Peripherin/RDS gene sequencing

讨 论

图1 adRP家系图谱系谱图注释：Fig 1 Pedigree of adRPNote:

图2 SNPs测序峰图Fig 2 Sequencing picture of SNP

据报道[9]，RHO和Peripherin/RDS基因分别占adRP致病基因的25%-30%和5%-10%，因此，本研究首先选取ROH(Exon1-5)、Peripherin/RDS(Exon 1-3)、ROMI(Exon1-3)、CRX(Exon2-4)和NRL(Exon2、3)基因的16个外显子进行初步筛查，结果发现在Peripherin/RDS基因上存在4处SNPs：910C>G、929G>A和1013A>G为 错 义 突 变， 对应的氨基酸改变为：Gln304Glu、Arg310Lys和Asp338Gly；318T>C为同义突变。其余候选基因未发现碱基改变。

RHO基因定位于3q21-q24，由5个外显子和4个内含子组成，长约6952bp，编码由348个氨基酸组成的视紫红质(rhodopsin，RHO)蛋白，该蛋白仅在视杆光感受器细胞中专一性表达，与RP发病早期即存在视杆细胞变性相一致[10]。目前，已发现100余种[6]RHO突变与RP有关，在这些突变谱中，90%以上是单个碱基突变，少数是小片段的插入或缺失突变(Indel)，一般不超过20个碱基。研究表明，Pro23His和Pro347Leu突变在欧美最为常见，Pro347Leu突变在我国较常见[11]。RHO基因突变率存在地区差异，我国低于欧美，约占adRP致病基因的7%[12]。本研究RHO基因未发现碱基改变，确定该基因与本研究adRP家系临床表型无关。

Peripherin/RDS 基因位于 6p21[13]，cDNA长 3 212个碱基，由3个外显子和2个内含子组成，编码由346个氨基酸组成的盘膜周边蛋白，表达于光感受器细胞内，其功能可能与光感受器的发生有关，并且维持外节盘缘的结构及其稳定性。Peripherin/RDS基因突变最重要的特点是疾病表型多样化，目前，公认的观点是由于修饰位点的存在和环境因素的影响所致[14]。Peripherin/RDS基因突变引起的表型改变可以分为四类：ADRP、进行性黄斑变性、双基因RP和视网膜图形样变性，该基因内不同位点和突变类型引起疾病的严重程度不同：第三和四跨膜区之间的错义突变和读框缺失引起ADRP和严重黄斑变性；分布于整个Peripherin/RDS基因的无意义突变引起图形样黄斑变性和双基因RP。本研究未发现该家系在Peripherin/RDS基因中存在致病突变，但在Peripherin/RDS基因外显子1和3编码区发现4处SNPs，均不与疾病共分离。说明Peripherin/RDS基因存在遗传异质性。

本研究家系患者临床表型差异性明显，其原因可能是由于核苷酸碱基的单倍体不同，或顺式或反式等位基因不同，也可能是环境因素影响了致病基因的突变，从而影响疾病的临床表型[15]。现通过直接测序的方法已排除RHO、Peripherin/RDS、ROM1、NRL和CRX基因与该家系临床表型相关，Peripherin/RDS基因外显子区发现的4处SNPs，与dbSNP数据库中(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/)的记录进行比对，未发现与本研究相同的SNP位点，因此，本研究发现的SNPs有可能是新的SNP位点。我们下一步的工作是，继续对剩余的18个adRP候选基因进行检测，鉴于用Sanger测序法工作量大，所需时间长，因此采用高通量测序技术进行后续工作(另文报告)。本家系表型差异性大，不排除存在新的致病基因的可能。

1 覃泳杰，郭海科. 常染色体遗传型视网膜色素变性相关基因的研究进展［J］. 眼科研究，2009，27（12）：1159-1163.

2 Daiger SP，Bowne SJ，Sullivan LS. Perspective on genes and mutations causing retinitis pigmentosa［J］. Arch Ophthalmol，2007，125（2）：151-158.

3 Kajiwara K，Berson EL，Dryja TP. Digenic retinitis pigmentosa due to mutations at the unlinked peripherin/RDS and ROM1 loci［J］.Science，1994，264（5165）：1604-1608.

4 Summaries of Genes and Loci Causing Retinal Diseases［EB/OL］.https：//sph.uth.tmc.edu/RetNet/sum-dis.htm.

5 庄文娟，邓大君，盛迅伦，等. 常染色体显性遗传RP患者视紫红质基因突变 的检测分析［J］. 眼科研究，2006，24（4）：348-351.

6 刘逾，贾晓林，李进军，等. 视网膜色素变性患者视紫红质基因突变分析［J］. 中国全科医学，2011，14（15）：1659-1662.

7 Matias-florentino M，Ayala-ramirez R，Graue-wiechers F，et al.Molecular screening of rhodopsin and peripherin/RDS genes in mexican families with autosomal dominant retinitis pigmentosa［J］.Curr Eye Res，2009，34（12）：1050-1056.

8 Ferrari S，Di IE，Barbaro V，et al. Retinitis pigmentosa：genes and disease mechanisms［J］. Curr Genomics，2011，12（4）：238-249.

9 Pagon RA，Daiger SP. Retinitis pigmentosa overview［M］.Washington：Gene Clinics，2005.

10 Zhang XL，Liu M，Meng XH，et al. A complete screen for mutations of the rhodopsin gene in a panel of Chinese patients with autosomal dominant retinitis pigmentosa［J］. Chin Med Sci J，2005，20（1）：30-34.

11 Zhang XL，Liu M，Meng XH，et al. Mutational analysis of the rhodopsin gene in chinese ADRP families by conformation sensitive gel electrophoresis［J］. Life Sci，2006，78（13）：1494-1498.

12 管涛，麻张伟，丁世萍. 散发性视网膜色素变性视紫红质基因突变筛查［J］. 中国眼耳鼻喉科杂志，2008，8（6）：351-353.

13 Travis GH，Christerson L，Danielson PE，et al. The human retinal degeneration slow（RDS）gene：chromosome assignment and structure of the mRNA［J］. Genomics，1991，10（3）：733-739.

14 周占宇，严密，陈大年. 盘膜边缘蛋白和杆体外节盘膜蛋白与视网膜光感受器 变性［J］. 中华眼底病杂志，1999，15（3）：197.

15 盛迅伦. 视网膜色素变性的遗传异质性和临床异质性［J］. 山东大学耳鼻喉眼学报，2011，25（5）：94-98.