紫草中β,β'-二甲基丙烯酰阿卡宁提取和含量测定及其稳定性研究

谢清春 陈燕忠 吕竹芬

广东药学院药物研究所，广东广州 510006

紫草中β,β'-二甲基丙烯酰阿卡宁提取和含量测定及其稳定性研究

谢清春 陈燕忠 吕竹芬▲

广东药学院药物研究所，广东广州 510006

目的测定不同产地的紫草中β,β'-二甲基丙烯酰阿卡宁（以下简称阿卡宁）的含量，比较不同溶剂对紫草中阿卡宁的提取率，并对阿卡宁的乙醇溶液稳定性进行考察。 方法 采用高效液相色谱法测定阿卡宁的含量，色谱柱为Dikma Diamonsil C18柱（200 mm×4.6 mm，5μm），以乙腈 - 水 - 甲酸（700:300:0.5）为流动相，流速 1mL·min-1，检测波长275 nm。测定了内蒙紫草、新疆紫草和云南紫草中阿卡宁的含量，考察了75%乙醇、乙醇、石油醚和液体石蜡对紫草中阿卡宁的提取率；将阿卡宁0.1 mg·mL-1乙醇溶液于冰箱4℃存放，定期进样测定，并与新配制时测定的峰面积比较。结果 测定的三种紫草中，以新疆紫草含量最高；乙醇和石油醚对阿卡宁的提取率高而75%乙醇和液体石蜡的提取率低；阿卡宁的乙醇溶液随存放时间的增加而峰面积变小。 结论 提取溶剂对紫草中阿卡宁提取率影响较大；由于阿卡宁溶液的不稳定性，选择阿卡宁作为评价含紫草药材制剂的指标成分并不合适。

紫草；β,β'-二甲基丙烯酰阿卡宁；提取率；高效液相色语法；稳定性

紫草为紫草科植物新疆紫草[1]Arnebia euchroma（Royle）Johnst.或内蒙紫草Arnebia guttata Bunge的干燥根。有些地区也用滇紫草Osma Paniculatum Bur.et Fr.的干燥根[2]。紫草具有清热凉血，活血解毒，透疹消斑之功效[1]。紫草的化学成分和药理活性研究表明，紫草含有多种生理活性成分，这些成分具有抗菌抗炎[3]、抗生育[4]、抗免疫低下、降血糖、保肝护肝脏[5]等多种作用。目前对紫草中有效成分能否有效提取及提取后的稳定性，尚未有深入的研究报道，本资料重点考察了紫草中的指标成分阿卡宁的提取及其在介质中的稳定性。

1 资料与方法

1.1 仪器与试剂

Dionex Ultimate3000 高效液相色谱仪（Dionex Corp.），KQ-300GDV台式恒温数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），BA110S 电子天平（Sartorius），冰箱（松下电器有限公司）。β,β'-二甲基丙烯酰阿卡宁对照品（中国药品生物制品检定所，批号111689-200502），新疆紫草、内蒙紫草及滇紫草（批号分别为 20060912-1、20060912-2、20060912-3，广州致信中药饮片有限公司）经鉴定为正品。乙醇（分析纯，广州化学试剂厂），石油醚（60～90℃，分析纯、天津致远化学试剂有限公司），液体石蜡（分析纯、天津致远化学试剂有限公司），乙腈（色谱纯、广州依能色谱有限公司），水为重蒸水。

1.2 含量测定方法

1.2.1 对照品溶液 精密称取阿卡宁对照品适量，加乙醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液即得。

1.2.2 供试品溶液 按中国药典方法，取紫草粉末（过四号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入石油醚（60～90℃）25 mL，称定重量，超声功率 250 W，频率 33 KHz，30 min，放冷，摇匀，精密称定重量，用石油醚（60～90℃）补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液10 mL，蒸干，残渣加流动相溶解并转移至10 mL量瓶中，加入流动相至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

1.2.3 色谱条件与系统适用性 以十八烷基键合硅胶为填充剂，以乙腈-水-甲酸（700∶300∶0..5）为流动相，流速1 mL·min-1，检测波长275 nm。在此条件下阿卡宁理论塔板数高于规定要求，对照品和样品的色谱图见图1。

图1 色谱图

1.2.4 线性关系考察 精密称定阿卡宁对照品10.854 mg，置10 mL 量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，即得标准储备液。精密吸取标准储备液 0.05、0.15、0.35、0.50、0.75 mL，置 5 mL 量瓶中，加流动相溶解，定容至刻度，分别取10 μL 进样测定，以峰面积对溶液浓度回归分析，得回归方程为A=48.099C-0.023 2，r=0.999 7。表明在浓度在0.01～0.15 mg/mL 范围内，线性关系良好。

1.2.5 精密度试验 取同一新疆紫草供试液10μL，注入高效液相色谱仪，连续测定5 次，记录色谱峰面积，供试品溶液峰面积RSD为1.46%。

1.2.6 重复性试验 取5份同一批次新疆紫草药材粉末各0.5 g，按供试品溶液制备方法处理定，测得阿卡宁平均含量为5.421 mg/g，RSD为1.40%，表明此方法重复性良好。

1.2.7 加样回收率试验 取已知含量（5.421 mg/g）的新疆紫草药材粉末0.4 g，精密称定6 份，分别精密加入乙酰阿宁对照品2 mg，按“2.1.2供试品溶液”的制备项下操作至取续滤液10 mL，蒸干，溶解并转移至20 mL的容量瓶中，加流动相稀释至刻度，分别精密吸取10 μL进样测定，测得阿卡宁的平均回收率为97.88%，RSD为2.36%，回收率试验符合要求。

2 结果

2.1 样品含量测定

取不同品种的紫草药材样品，制备供试品溶液，进样测定，按外标法分别计算阿卡宁的含量[6]，结果表明测定的不同品种的紫草中阿卡宁的含量差异较大，其中新疆紫草和内蒙紫草的含量符合规定而云南紫草含量不符合药典“按干燥品代，阿卡宁不得少于0.3%”的规定。见表1。

表1 不同紫草中阿卡宁含量测定结果

2.2 阿卡宁对照品的稳定性试验

在实验过程中笔者发现，阿卡宁0.1 mg/mL对照品溶液存放时间越长，色谱峰面积越小，因此笔者对阿卡宁0.1 mg/mL对照品溶液的稳定性进行了研究，存放条件为冰箱中4℃冷藏。见表2。

这表明0.1 mg/mL的阿卡宁不稳定，存放过程中含量降低，因此对照品溶液配制后不可以长期使用。结果也提示，在提取物含有阿卡宁的制剂中，随着制剂存放时间的增加，阿卡宁可能产生含量下降的变化，选择阿卡宁作为此类制剂含量评价指标并不合适[7]。

2.3 不同溶剂对紫草中阿卡宁提取率

为了比较不同提取溶剂对紫草中阿卡宁提取率，我们采用常用的75%乙醇、乙醇、石油醚和液体石蜡4种提取溶剂对新疆紫草的阿卡宁的提取作了比较，操作方法同1.2.2。

结果采用乙醇或石油醚提取，阿卡宁含量无明显差异，但用75%乙醇或石蜡提取则提取率较低，提示在含紫草的中药制剂中如用上述与两种溶剂提取不利于有效成分的提出。见表3。这可能因为阿卡宁是非极性物质，脂溶性强，75%乙醇极性较大，阿卡宁在75%乙醇中的溶解度较小，液体石蜡虽然为非极性溶剂，但其渗透性差，因而对阿卡宁的提取率也低。

3 讨论

本文研究表明液体石蜡对阿卡宁提取率低，实际生产中有些厂家采用液体石蜡提取紫草并不合适。对阿卡宁0.1 mg/mL对照品的乙醇溶液稳定性考察结果显示，阿卡宁乙醇溶液不稳定，容易降解。预示在制剂中阿卡宁随着存放时间的延长，也可能降解，选择阿卡宁作为含紫草类药材制剂检测的指标成分可能并不合适。尽管药典规定采用阿卡宁作为紫草含量测定的指标成分，但鉴于其在制剂中存在不稳定的可能性[8]，建议在含紫草的制剂中选择另一种相对稳定的成分作为检测的指标成分。

表2 阿卡宁对照品溶液面积随时间变化表

表3 不同溶剂对紫草中阿卡宁提取率

[1]国家药典委员会.中国药典一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：320.

[2]张超，何宝丰，张庆芝.昆明滇紫草的生药学研究 [J].湖南中医药大学学报，2011， 31（7）：32-34.

[3]赵雪梅，邓 文，李莹.紫草不同提取物抗炎及抑菌作用实验研究 [J].时珍国医国药，2008，19（7）：1603-1605.

[4]马宝华，邴鲁军，王哲民，等.中药紫草抗生育作用的研究 [J].山东医科大学学报，1993，31（1）：34-36.

[5]刘燕，买尔旦·马合木提，尼加提·热合木.新疆紫草提取物对小鼠急性四氯化碳性肝损伤的保护作用 [J].时珍国医国药，2006，17（9）：1676-1678.

[6]姚闽，段春玲，胡蓉，等.不同产地及批次的新疆紫草中乙酰阿卡宁的含量测定 [J].江西医药，2010，45（7）：690-691.

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Extraction and determination of β,β'-dimethylacrylalkannin in lithospermum erythrorhizon and study on its stability

XIE Qingchun CHEN Yanzhong LV Zhufen
Institute of Material Medica, Guangdong Pharmaceutical College, Guangzhou 510006, China

Objective To determine the β,β'-dimethylacrylalkannin in lithospermum erythrorhizon, compare the extracting rate of different solvents to β,β'-dimethylacrylalkannin and study the stability of standard β,β'-dimethylacrylalkannin solution of alcohol.Methods A HPLC method was used to determine the β,β'-dimethylacrylalkannin.Dikma Diamonsil C18 chromatogram column(200 mm×4.6 mm, 5μm) was used, Acetonitrile-water-Formic acid(700:300:0.5) as mobile phase, flow rate at 1mL·min-1, detection wavelength at 275 nm.β,β'-dimethylacrylalkannin in Arnebia euchroma (Royle) Johnst,Arnebia guttata Bunge and Osma Paniculatum Bur.et Fr.was determined.The extracting rate of four solvents (75% alcohol,alcohol, petroleum ether and liquid paraffin) was studied.The 0.1mg·mL-1solution of standard β,β'- dimethylacrylalkannin was stored at 4 ℃ in Refrigerator, and was injected to the HPLC system at intervals.Results The β,β'- dimethylacrylalkannin content in Arnebia euchroma (Royle) Johnst.was the highest.Extracting rate of alcohol and petroleum ether was more than 75% alcohol and Liquid paraffin.The peak area of 0.1mg·mL-1solution of standard β,β'- dimethylacrylalkannin decreased as the storage time extended.Conclusion Since the alcohol solution of β,β'- dimethylacrylalkannin was unstable, choosing β,β'- dimethylacrylalkannin as the index component in formulations concluded Lithospermum erythrorhizon was improper.

Lithospermum erythrorhizon; β,β'- dimethylacrylalkannin; Extracting rate; HPLC; Stability

R284.2；R927.11

A

2095-0616（2012）06-26-03

▲通讯作者

2012-02-20）