顺铂对肝癌HepG2细胞增殖抑制作用的实验研究

周丽霞，杨 森，那文婷，陆 莉，王译擘，吴 珏，张 巍 (吉林医药学院:.临床医学院，.基础医学院，3.生化教研室，吉林 吉林 303)

肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，死亡率高。对于肝癌的治疗手段主要有手术治疗、放疗和化疗等，其中化疗是综合治疗的主要手段之一，而肿瘤细胞增殖的研究是评价化疗药效的一个重要指标［1-2］。顺铂(cisplatin，DDP)是一种用于化疗的铂制剂，并且在多种实体瘤的治疗中显示了确切的疗效。临床上顺铂的应用已有很久的历史，1969年Rosenberg首次报道了顺铂的抗癌效应［3］，但是其单独用药对肝癌HepG2细胞抑制作用的实验研究则不多见。因而本实验研究顺铂对肝癌HepG2细胞增殖的影响，从而为顺铂的抗肝癌作用提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

HepG2细胞由吉林医药学院免疫教研室惠赠;顺铂购自山东齐鲁药业公司;MODEL 550型酶标仪(BIO-BAD公司);LXJ-Ⅱ型离心沉淀机(上海医用分析仪厂);H110D电子分析天平(美国Sartorius);倒置显微镜(上海医用分析仪厂)。

1.2 细胞培养

HepG2细胞培养在含10%新生小牛血清的完全培养液中培养于37℃、5%的CO2培养箱中，细胞呈贴壁状态生长，在倒置显微镜下观察细胞生长状况并拍照，适量时进行细胞传代。

1.3 MTT比色法测CDDP的抑制率

取对数生长期的HepG2细胞，调细胞悬液密度为1×104个/mL，按100μL/每孔接种于96孔培养板。并用顺铂与完全培养液配制成5、10、15、20 μg/mL不同的浓度培养，设置不加药的对照组和不加MTT的空白对照组，复孔数为3。待细胞贴壁后弃去培养液，给药后培养24 h，期间在倒置显微镜下密切注意观察细胞生长状态并拍照。24 h后每孔加入20 μL MTT［4］37 ℃ 孵育 4 h，弃去上清后每孔加150 μL DMSO(二甲基亚砜)，在摇床上低速振荡10 min，酶标仪570 nm波长测得吸光度值并记录结果。利用标准曲线计算 IC50［5］。

1.4 统计学分析

对全部数据采用统计学分析，组间采用t检验处理。

2 结果与讨论

2.1 倒置显微镜下观察细胞形态变化

顺铂对肝癌HepG2细胞生长的抑制作用的形态观察见图1。在显微镜下可见未加顺铂细胞生长状态良好，加顺铂后在显微镜下观察细胞体积缩小，连接消失，与周围细胞脱离，生长状态极差。

2.2 顺铂对HepG2细胞增殖的影响

不同浓度顺铂处理Hela细胞24h后采用MTT法测得各组吸光度，计算顺铂对肝癌HepG2细胞生长的抑制率，结果表明肝癌细胞的抑制率对顺铂的浓度呈明显剂量相关性，顺铂的浓度分别为5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL。以空白组做对照，测得各组OD值(见图2)。从图中可看出不同浓度顺铂对肝癌HepG2细胞的生长均有抑制作用，各组与对照组比较有显著差异(P＜0.05或P＜0.01)。通过标准曲线可计算出顺铂对HepG2细胞的IC50为8.97 μg/mL。

3 讨论

顺铂为治疗多种实体瘤的一线药［6］，顺铂为无机水溶性铂类络合物，分子结构中铂原子发挥重要作用，可与DNA分子中鸟嘌呤或嘧啶碱基结合，形成DNA链内或链间交联，影响DNA合成与复制，抑制癌细胞分裂。顺铂的多方面临床作用与其具有强氧化性有关，DDP的强氧化性能够有效阻断细胞增殖的过程，抑制细胞分裂，同时能够诱导原有肿瘤细胞多种凋亡蛋白表达，促进其最终走向死亡［7］。有研究表明，顺铂可以通过细胞特异性Caspases依赖的信号途径诱导凋亡，发挥杀瘤效应［8］。Caspases是凋亡信号转导的共同通路，许多调控细胞凋亡的因素都通过Caspases酶系起作用的。其中Caspase-3为凋亡的效应因子，负责对凋亡途径最后执行阶段的全部或部分关键性蛋白酶的剪切，被称为凋亡的“执行者”［9-10］。

图1 不同浓度的顺铂对Hepg2细胞形态的影响:A.对照组;B.5 μg/mL;C.10 μg/mL;D.15 μg/mL;E.20 μg/mL

图2 不同浓度顺铂对HepG2细胞增殖的影响

肿瘤共同的生物学特征是失控性生长，其主要分子机制是细胞周期紊乱导致细胞增生过多和凋亡减少，因此抑制肿瘤细胞增殖，诱导其凋亡已成为肿瘤治疗的重要手段之一［11］。因此本实验选用形态学观察及MTT法对其抗增殖及诱导凋亡进行初步的测定，测定出顺铂对肝癌HepG2细胞最佳的作用剂量。在显微镜下可见未加顺铂时细胞生长状态良好，加顺铂后细胞生长受抑制，生长状态差，在显微镜下细胞皱缩，且具有剂量依赖性。本研究结果显示:顺铂对肝癌HepG2细胞有抑制增殖作用，但其在诱导肝癌细胞凋亡的过程中，凋亡相关基因的变化及凋亡信号的产生还有待深入研究，以进一步阐述顺铂的作用机理。

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