响应面分析法优化栀子黄色素提取工艺条件

胡 琪，饶力群，唐忠海，冯静弦

（湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128）

颜色是衡量食品质量的重要指标之一，19世纪以前人们都使用天然色素着色。1856年英国的Perkins发明了第一个合成有机色素——苯胺紫，揭开了合成色素应用的新纪元[1]。由于合成色素具有色泽鲜艳、着色力强、稳定性好及成本低廉等优点，所以几乎取代了天然色素在食品中的应用[2]。近年来，人工合成色素的毒性和不良影响不断被发现，天然食用色素的开发和应用就越来越被人们所重视。栀子黄色素是从栀子果实中提取出来的一类天然水溶性黄色素，作为天然食用色素，它安全无毒，应用范围广，成本较低，着色力强，具有一定的营养价值，在世界市场上颇受欢迎[3-4]。

响应面分析法（Response Surface Methodology,RSM）是一种优化工艺的有效方法，可用于确定各自变量因素及其交互作用在工艺过程中对响应值的影响，精确表达因素和响应值之间的关系[5-6]，寻求最佳工艺参数。近年来，响应面分析法已被越来越多的应用于食品工业的分析研究中，但是在栀子黄色素提取工艺的研究尚未见报道。本文以提取液在波长为440 nm处的吸光值（A）为响应值，在单因素实验的基础上，利用响应面法对栀子黄色素的浸提工艺进行了优化，得到提取工艺的最优组合，以提高栀子黄色素的提取效率，达到提高色价的目的。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验原料 栀子果实，购于长沙市高桥批发市场，剥壳，粉碎，备用。

1.1.2 试验试剂 无水乙醇，分析纯，长沙安泰精细化工实业有限公司；超纯水，湖南农业大学纯水室提供。

1.1.3 试验仪器与设备 RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），电热恒温风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司），回流提取仪、ALZ04电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司），FW177中草药粉碎机（天津泰斯特），紫外-可见分光光度检测器（Agilent1100）。

1.2 试验方法

1.2.1 栀子黄色素的提取 精确称取10 g栀子黄粉末于圆底烧瓶中，加入一定量一定浓度的乙醇，在一定温度下浸提一定时间，提取液抽滤，浓缩回收乙醇，得粗提液。

1.2.2 测定方法 采用分光光度法测定440 nm处提取液的吸光值A440。用1 cm的比色皿，以蒸馏水为空白，粗提液于Agilent1100紫外－可见分光光度计上进行测定。

1.2.3 响应面法优化提取条件 在单因素实验的基础上，采用Box-Behaken方法[7-8]，选取主要影响因素作为自变量，吸光值A做为响应值。通过响应曲面进行栀子黄色素提取工艺的研究。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 提取时间对吸光值的影响 按1.2.1方法，在60%乙醇、料液比1∶12、温度60℃、提取1次的条件下，考察不同提取时间对吸光值的影响，结果见图1。由图1可知，提取时间从2 h到4 h时，吸光值在不断的增大，4 h时达到最大值，继续延长提取时间，吸光值变小，可能是由于提取时间过长原料中的杂质被不断溶出，影响了提取效果。

图1 提取时间对吸光值的影响

2.1.2 乙醇浓度对吸光值的影响 按1.2.1方法，在提取时间为4 h、料液比1∶12、温度60℃、提取1次的条件下，考察不同乙醇浓度对提取效果的影响，结果见图2。由图2可知，乙醇浓度从40%到60%时，吸光值在不断的增大，60%时达到最大值，继续加大乙醇浓度，吸光值变小。可能是由于乙醇浓度过高，导致部分栀子黄色素被破坏。

图2 乙醇浓度对吸光值的影响

2.1.3 料液比对吸光值的影响 按1.2.1方法，在60%乙醇、提取时间为4 h、温度60℃、提取1次的条件下，考察不同料液比对提取效果的影响，结果见图 3。由图3 可知，料液比从 1∶6 到 1∶12 时，吸光值在不断的增大，1∶12时达到最大值，继续加大料液比值，吸光值变小，可能是由于原料中其他成分过多溶出反而不利于色素的提取，影响了提取效果。

图3 料液比对吸光值的影响

2.1.4 提取温度对吸光值的影响 按1.2.1方法，在60%乙醇、料液比1∶12、提取时间为4 h、提取1次的条件下，考察不同提取温度对提取效果的影响，结果见图4。由图4可知，提取温度从40℃到60℃时，吸光值不断增大，60℃时达到最大值，继续升高温度，吸光值变小，可能是由于温度过高，原料中的栀子黄色素被破坏，影响了提取效果。由图4看出，提取曲线比较平缓，说明提取温度不是提取效率的主要影响因素。

图4 温度对吸光值的影响

2.2 响应面法优化栀子黄色素的提取工艺

2.2.1 响应面分析方案与试验水平 根据Box-Behnken试验设计原理，在单因素实验结果基础上，选取乙醇浓度、料液比、提取时间3个因素的合适水平，对提取工艺进行3因素3水平响应面分析试验，其具体试验方案见表1。

表1 响应面分析因素水平表

2.2.2 响应面分析结果 对栀子黄色素提取工艺进行响应面分析，结果见表2。

2.2.3 方差分析和二次回归方程拟合 利用Design Expert软件对试验结果进行二次多元回归拟合，得到以栀子黄色素吸光值为响应值，与编码自变量X1，X2，X3的二次多项回归方程：

模型的可靠性可从方差分析（表3）及相关系数来考察。结果表明，模型是显著的（p<0.05），此模型线性相关系数R2=0.922 2，调整性决定系数R2=0.822 1，说明回归方程拟合度很好，能够很好地描述试验结果，可以用此模型对栀子黄色素提取量进行分析和预测[9]。由F检验可以得到因子贡献率为X2>X3>X1，即料液比>时间>乙醇浓度。

此回归模型预测了乙醇浓度（X1）、料液比（X2）和提取时间（X3）在栀子黄色素提取中的作用。从变量和响应值之间关系的方差分析（表3）中可知：X2、X32极显著，X2X3、X12显著。由此可知，X2、X2X3、X12、X32对吸光值A有比较显著的影响，而其他因素的影响相对较小。各个具体实验因子与响应值都不是简单的线性关系。

表2 响应面分析方案及实验结果

2.2.4 交互作用分析 各因素X1、X2、X3对响应值A440所构成的三位空间的曲面图，可反映各因素对响应值的影响。响应面图可较为直观的看出各因素对吸光值的影响，曲线越陡峭，表明该因素对吸光值的影响越大，由等高线图可以看出存在极值的条件应该在圆心处。图5～图7表明，在所选的各因素水平范围内，对栀子黄溶液吸光值的影响，料液比最大（X2），提取时间次之（X3），乙醇浓度（X2）的影响最小。这也符合表3中对方程3个交互项的方差结果分析。比较3组等高线可知，图6的高等线图呈椭圆形，说明X2、X3的交互作用较显著。

2.2.5 验证试验 在软件给出的处理方案中本实验选择的最佳工艺条件为乙醇浓度58.36%（实际取 58%），料液比 1∶10，提取时间 4.18 h（4.2 h）时，预测最优值为0.748 2。根据选择的最佳工艺进行试验来验证是否符合模型方程式预测的最佳响应值，进行3次平行试验，得到栀子黄色素提取液实际吸光值为0.735 2，与理论值相差不显著，说明响应值的实验置与回归方程预测值吻合良好，证明优化结果可信，具有实用价值。

表3 响应面分析方案与实验结果

图5 乙醇浓度和料液比对吸光值的响应面图和等高线图

图6 乙醇浓度和提取时间对吸光值的响应面图和等高线

图7 料液比和提取时间对吸光值的响应面图和等高线图

3 结论

用响应面分析法建立了栀子黄色素提取过程中，乙醇浓度、料液比、提取时间3个影响因素的回归模型，并对模型经过分析检验，试验结果表明响应面法优化栀子黄色素提取工艺可行。

通过Design-Expert7.0软件采用Box-Benhnken实验设计对栀子黄色素提取工艺参数进行优化，得到了最佳提取工艺为：乙醇浓度58.36%，料液比1∶10，提取时间4.18 h，栀子黄色素提取液在波长440 nm处最大预测吸光值为0.748 2。结合生产实际，可调整栀子黄色素提取的最佳工艺条件为乙醇浓度58%、料液比1∶10、提取时间4.2 h，实际吸光值为0.735 2。本研究可为工业化最大效率利用栀子资源，提取天然栀子黄色素提供生产数据。

[1]蔺定运.食用色素的识别与应用 [M].北京：中国食品出版社，1987.

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[3]阎少辉，张德权.栀子色素研究进展与开发[J].食品研究与开发，2000，21（6）：28-31.

[4]付小梅，周光雄，葛菲，等.栀子类药材的研究概况及展望[J].中国野生植物资源，2001，20（2）：24-26，30.

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[8]杨文雄，高彦祥.响应面法及其在食品工业中的应用[J].中国食品添加剂，2005，（2）：68-71.

[9]袁志发，周静芋.试验设计与分析[M].北京：高等教育出版社，2000.381.