免疫固定电泳法检测尿本－周蛋白的临床应用

曾祝伦，张司兰，熊 曼

（1.重庆医科大学附属第二医院检验科 400010；2.重庆市璧山县人民医院心血管内科 402760）

尿本－周蛋白（Bence－Jones protein，BJP）是监测浆细胞病和B淋巴细胞增殖性疾病的一个重要指标，其阳性结果与多发性骨髓瘤的发病密切相关。浆细胞恶性增殖时合成大量BJP，其实质是蛋白轻链合成紊乱。BJP大约由214个氨基酸组成，其结构与正常的免疫球蛋白轻链相同，有κ、λ轻链，具有特殊的热沉淀性质。血清蛋白电泳、免疫球蛋白定量和热沉淀反应等是临床尿BJP检测的主要方法［1］，由于上述方法的影响因素较多［2］，其特异性和灵敏度不理想，检测效率低。本文采用免疫固定电泳检测非浓缩尿中的BJP，以探讨其临床应用价值。现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 主要试剂：2mol／L乙酸缓冲液、200g／L磺基水杨酸、尿蛋白电泳试剂盒（法国Sebia公司）及免疫固定电泳试剂盒（法国Sebia公司）。主要仪器：全自动电泳仪及扫描仪（法国Sebia公司）、AU560全自动生化分析仪（日本OLYMPUS公司）。

1.2 样本 140例晨尿样本均来自2004年5月至2008年4月重庆医科大学附属第二医院的门诊和住院患者，2～8℃保存，1周内集中检测。其中多发性骨髓瘤26例，淋巴瘤白血病20例，粒细胞性白血病12例，肾病60例，骨髓移植2例，其他疾病20例。

1.3 免疫固定电泳及热沉淀反应法检测 蛋白质在pH 8.8巴比妥－巴比妥钠缓冲液中电泳分离。将晨尿样本进行免疫固定电泳和热沉淀反应试验。采用重链γ（IgG）、α（IgA）、μ（IgM），轻链κ、λ，游离轻链κ、λ等5种抗血清及蛋白固定液进行免疫固定，经蛋白固定液固定的条带将显示电泳后的蛋白质全貌，并将其作为参考泳道（electrophoresis，ELP）。用结晶紫对沉淀的蛋白进行染色，多余染料用酸性介质冲洗。将检测结果进行扫描分析。热沉淀反应法参照全国临床检验操作规程进行试验［3］。

2 结 果

2.1 BJP免疫固定电泳 采用Sebia全自动电泳仪对140例晨尿样本进行十二烷基硫酸钠－琼脂糖凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate－agarose gel electrophoresis，SDS－AGE），76 例 存 在异常区带，异常区带的相对分子质量为25 000或50 000。将存在异常区带的76例晨尿样本进行BJP免疫固定电泳，发现有42例样本中尿BJP阳性，其中IgGκ型BJP 26例，IgMλ型BJP 16例，见图1。热沉淀反应法检测仅有24例为尿BJP阳性。

2.2 免疫固定电泳检测的灵敏度 免疫固定电泳检测出尿BJP阳性的尿蛋白浓度为20mg／L，当浓度达2 000mg／L时，未发现干扰；而热沉淀反应法检测出尿BJP阳性的尿蛋白浓度达320mg／L，在浓度为1 280mg／L时，即出现干扰。

2.3 尿蛋白电泳与BJP的关系 对76例尿蛋白SDS－AGE出现异常BJP区带的样本进行BJP免疫固定电泳。结果显示，尿蛋白电泳出现异常BJP区带的阳性率为55.3%（42／76），见表1。

2.4 免疫固定电泳检测的效率 将76例尿蛋白SDS－AGE出现异常BJP区带的样本采用BJP免疫固定电泳和热沉淀反应法分别检测，结果显示，免疫固定电泳检测尿BJP阳性为42例（57.1%），热沉淀反应法检测尿BJP阳性为24例（31.6%），见表2。

图1 非浓缩尿蛋白免疫固定电泳图

表1 非浓缩尿蛋白电泳的效率［n（%）］

表2 BJP免疫固定电泳与热沉淀反应法检测的效率［n（%）］

3 讨 论

BJP是一种单克隆游离免疫球蛋白轻链，具有特殊的热沉淀性质，因此实验室主要以热沉淀反应法检测尿BJP。本研究结果显示采用热沉淀反应法，尿BJP的检出率仅为31.6%。由于该法检测灵敏度低（尿蛋白浓度为320mg／L时显示尿BJP阳性，而尿蛋白浓度为1 280mg／L即出现干扰），因此，将其用于BJP的过筛试验存在较大的漏检率。

由于机体某个克隆发生病变而分泌大量单一、均质的单克隆蛋白，又称M蛋白。多发性骨髓瘤、Waldenstrom′s巨球蛋白血症、白血病和淋巴细胞瘤等疾病均伴有单克隆B细胞的增殖，后者产生大量完整的免疫球蛋白分子和蛋白轻链［4］。在疾病初期，这些蛋白轻链（相对分子质量为25 000）被肾小球滤出后在肾小管分解代谢，使尿BJP常呈阴性。随着肿瘤的增大，合成的自由轻链增多，并超过肾小管的重吸收能力，造成BJP在肾小管中与游离钙结合、沉淀，在肾小球毛细血管中淤积，导致肾单位破坏、肾功能减退，出现蛋白尿、管型尿，甚至血尿。免疫固定电泳是一种灵敏度、特异性较高的分离及鉴定蛋白质的方法［5］。靶抗原在载体上电泳后，将抗血清直接作用于待检蛋白，可对待检样本中的蛋白成分进行鉴别。同时，免疫固定电泳不仅可用于M蛋白的分型，还可对存在M蛋白的患者进行早期诊断，其灵敏度、特异性优于骨髓细胞检查。由于多发性骨髓瘤患者的浆细胞呈点性增殖，骨髓细胞形态学检查的病理取样存在较大的不确定性［6］，往往要在患者中、晚期进行多部位、多次骨穿，且瘤细胞大小超过正常10.0%才可作出诊断，而免疫固定电泳可弥补这方面的不足［7］。本研究将样本进行免疫固定电泳，ELP显示电泳后的蛋白质全貌，其余5条泳道鉴定单克隆成分，通过他们与重链γ（IgG）、α（IgA）、μ（IgM），轻链κ、λ及游离轻链κ、λ这5种抗血清是否反应进行成分鉴别［8］。

本研究发现，出现异常区带的样本中BJP检出阳性率为55.3%，仍有44.7%为假阳性，这与某些小分子蛋白（如α1球蛋白）也可出现该条带有关。因此，SDS－AGE尿蛋白电泳只能作为筛选异常蛋白的方法，若出现异常电泳区带，还需进一步采用免疫固定电泳检测确认。采用免疫固定电泳检测BJP，尿液样本以收集24h尿或晨尿为佳，要提高电泳检测的灵敏度可浓缩尿液。但尿液浓缩的方法目前尚有待标准化。本实验采用非浓缩晨尿进行检测，结果表明免疫固定电泳对非浓缩尿也具有良好的灵敏度和特异性，与Levinson和Keren［9］的报道一致。

利用非浓缩尿对BJP进行免疫固定电泳，可提高M蛋白病的临床诊断率。目前，多发性骨髓瘤的发病呈明显上升趋势［10－12］，因此，加强这一领域的研究，将有助于 M 蛋白病的早期发现。

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