小鼠心脏移植急性排斥反应模型的建立

刘琛 王斌 武多娇 王春生

（复旦大学附属中山医院心外科，＊实验研究中心，上海 200032）

心脏移植模型是器官移植实验研究中最常用的模型，1973年Corry等[1]首次建立小鼠心脏移植模型。之后Matsuura等[2]成功将Cuff技术运用于小鼠颈部心脏移植模型，使手术难度大大降低。本研究借鉴Cuff技术，旨在建立BALB／c小鼠和C57BL／6小鼠颈部心脏移植模型，观察移植心脏急性排斥反应，为今后的移植免疫研究奠定基础。

1 资料与方法

1.1 实验材料 选用8～10周龄BALB／c小鼠和C57BL／6小鼠，体质量约25 g，雄性，购自复旦大学实验动物科学部。分两组进行心脏移植试验，每组各20对小鼠。实验组的供受体分别为BALB／c小鼠和C57BL／6小鼠，对照组的供受体均为BALB／c小鼠。常规显微手术器械购自上海医疗器械厂，10倍双人双目显微手术放大镜（上海医用光学仪器厂SXP-1C型），9-0、10-0医用无损伤血管缝线购自上海浦东金环医疗用品有限公司。

1.2 手术方法

1.2.1 受体的准备 用1%的戊巴比妥钠（50mg／kg）麻醉受体小鼠后，将其固定于简易手术台。皮肤以安尔碘消毒后，采用右侧颈部纵切口，上至下颌骨，下至锁骨。切除下颌腺及部分胸锁乳突肌，游离右侧颈外静脉，于颈浅静脉分叉处结扎后，近心端用9-0缝线打活结暂时封闭血流，在近结扎端处切断，用含50 U／mL肝素的0.9%氯化钠溶液冲洗，安装外径0.8 mm、内径0.5 mm的Cuff，用10-0的缝线固定。尽可能游离颈总动脉，于颈管内、外动脉分叉处结扎后，近心端用血管夹阻断血流，于结扎点的近心端切断，50 U／mL肝素0.9%氯化钠溶液冲洗，安装外径0.6 mm、内径0.4 mm的Cuff管，用10-0的缝线固定。

1.2.2 供体心脏的获取与修整 供体小鼠用与受体小鼠相同的方法麻醉后固定于简易手术台。皮肤以安尔碘消毒后，正中切口开腹，显露下腔静脉，注入4℃含50 U／mL肝素的0.9%氯化钠溶液1 mL后，沿双侧腋前线整块切除胸前壁，将心脏连同胸腺组织和肺完整切取后，迅速置于4℃乳酸林格氏冰水混合物中。心脏完全停止跳动后，分离胸腺组织和食管；完全游离主动脉，在无名动脉水平予以横断；游离肺动脉至分叉处切断；用9-0缝线结扎下腔静脉、上腔静脉及肺静脉（尽量靠近心脏），并于远心端切除肺组织。

1.2.3 移植手术 将修整好的供体心脏置于受体的手术切口内，表面覆盖4℃0.9%氯化钠液浸湿的纱布。先将供体心脏的主、肺动脉套于受体已装好Cuff管的颈外静脉，用10-0的缝线固定，再将供体心脏的主动脉套于受体已装好Cuff管的颈总动脉，用10-0的缝线固定。先后开放颈外静脉和颈总动脉的血流，同时用预热的0.9%氯化钠溶液迅速复温。血管开放后，可见主动脉、肺动脉及冠状动脉充盈，移植心脏颜色迅速由苍白变为鲜红，1 min左右心脏由纤颤转为规律搏动。待移植的心脏复跳稳定后，将心尖朝向头侧摆正移植心位置，腹腔注射0.5 mL0.9%氯化钠溶液，用5-0丝线连续缝合关闭切口。

1.3 观察指标

1.3.1 手术成功的标准 以移植心脏成功复跳，连续搏动超过3 d为手术成功。

1.3.2 组织病理学分析 移植后第7天，在实验组和对照组受体小鼠中随机选取10只小鼠处死，取移植心脏标本，保存在10%多聚甲醛中。将心脏组织用石蜡包埋、切片（切片厚度为4～8μm）、脱水、固定，用苏木精－伊红染色，进行组织病理学分析。移植心脏排斥反应分级参照1990年国际心肺移植协会心脏移植急性排斥反应分级标准[3]。

1.3.3 移植心脏存活时间的观察 对于手术成功的受体小鼠，肉眼观察及直接触摸移植心脏均无搏动时，判为急性排斥反应终点，统计移植心脏的存活期。

1.4 统计学处理 采用SPSS11.5统计软件分析。数值变量以表示，两组比较采用配对t检验。所有统计学计算均采用双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 手术成功率 术后移植心脏复跳率达100%，实验组1只小鼠术后未苏醒，可能与术中失血过多有关。对照组1只小鼠苏醒后出血过多而死亡，另1只小鼠术后第2天移植心脏停跳。手术成功率达92.5%（37／40）。

2.2 术后第7天移植心脏组织病理学结果 实验组移植心脏可见心肌细胞间质有大量淋巴、巨噬细胞浸润，并有心肌水肿、溶解、坏死，急性排斥反应等级为3.55±0.44；对照组移植心脏仅见间质少量淋巴细胞浸润，无坏死改变，急性排斥反应等级为0.40±0.32；两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。两组移植心脏组织的病理图片见图1。

图1 实验组和对照组移植心脏的心肌组织病理学检查（HE，×200）

2.3 两组移植心脏存活时间比较 实验组剩余的9只小鼠移植心脏存活（8.22±0.67）d，对照组剩余的8只小鼠移植心脏存活＞100 d（见图2），两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

图2 两组移植心脏存活时间比较

3 讨 论

小鼠颈部心脏移植较腹部心脏移植，操作简便、手术时间短；对小鼠的生理状况影响小，小鼠术后存活率高，且便于观察移植心脏搏动情况。但小鼠颈部心脏移植对术者的吻合技术以及对设备要求较高，且易出现吻合口出血及血栓形成。将Cuff技术运用于小鼠颈部心脏移植，手术难度大大降低，且出血明显减少，易于保证术后吻合口的通畅。

BALB／c和C57BL／6小鼠是纯系的同种小鼠，具有不同的主要组织相容性抗原（MHC-Ⅰ、Ⅱ），可应用于同种排斥反应的免疫学研究。BALB／c小鼠以 Th2型为主，C57BL／6 小鼠以 Th1型为主[4]。同种移植急性排斥反应主要由Th1介导[5]。小鼠心脏移植急性排斥反应模型的供受体分别为BALB／c和 C57BL／6[6]。

本研究中，我们对Cuff套管法稍作改进，先进行受体准备，再获取供体心脏，控制供体心脏的缺血时间在30 min以内；血管开放后，移植心脏颜色迅速由苍白变为鲜红，1 min之内移植心脏即可复跳，复跳率100%。由于颈外静脉较短，且分支较多，我们创新性地对其用9-0缝线活结阻断，而未使用血管夹，增大了手术操作范围，提高了成功率。受体的动静脉套管完成后，分别将其套入供体心脏的主动脉和肺动脉，第一个结打于结扎线远端，以防止血栓形成，第二个结打于结扎线近端，以防止结扎线脱落。

本研究中，实验组与对照组相比，术后8 d左右移植心脏停跳，心肌组织的病理学表现为大量淋巴细胞浸润、心肌细胞水肿或坏死，说明小鼠心脏移植急性排斥反应体外模型已成功建立。该模型操作简单，无需深厚的显微外科功底，且重复性好，手术成功率高，值得推广。

[1]Corry RJ，Winn HJ，Russell PS.Primarily vascularized allografts of hearts in mice.The role of H-2D，H-2K，and non-H-2 antigens in rejection [J].Transplantation，1973，16（4）：343-350.

[2]Matsuura A，Abe T，Yasuura K.Simplified mouse cervical heart transplantation using a cuff technique[J].Transplantation，1991，51（4）：896-898.

[3]Billingham ME，Cary NR，Hammond ME，et al.A working formulation for the standardization of nomenclature in the diagnosis of heart and lung rejection：Heart Rejection Study Group.The International Society for Heart Transplantation[J].Heart Transplant，1990，9（6）：587-593.

[4]Wang H，Hosiawa KA，Min W，et al.Cytokines regulate the pattern of rejection and susceptibility to cyclosporine therapy in different mouse recipient strains after cardiac allografting[J].J Immunol，2003，171（7）：3823-3836.

[5]van Besouw NM，Daane CR，Vaessen LM，et al.Different patterns in donor-specific production of T-helper 1 and2 cytokines by cells infiltrating the rejecting cardiac allograft[J].J Heart Lung Transplant，1995，14（5）：816-823.

[6]Shariff H，Greenlaw RE，Meader L，et al.Role of the Fc region in CD70-specific antibody effects on cardiac transplant survival[J].Transplantation，2011，92（11）：1194-1201.