黄芩解毒颗粒提取工艺研究

王洛临，施之琪，李智勇，陈玉兴

(广东省中医研究所广东 广州 510095)

黄芩解毒颗粒提取工艺研究

王洛临，施之琪，李智勇，陈玉兴

(广东省中医研究所广东 广州 510095)

目的优选黄芩解毒颗粒的提取工艺。方法以解热、抗炎药效为指标，对本处方的提取工艺路线进行初步筛选，根据药效筛选结果，采用正交试验设计，以挥发油得量为指标，对加水量、浸泡时间和蒸馏时间进行优选;以干浸膏得量和黄芩苷含有量的综合评分值为指标，对加水量、提取时间和提取次数进行优选。结果提取工艺路线采用双提法最好，挥发油提取最佳工艺为加12倍水，提取6 h;水提取最佳工艺为提取3次，每次加8倍水，提取1 h。结论选择的提取工艺路线有效，优选的提取工艺稳定可行。

黄芩解毒颗粒;抗炎;解热;提取工艺;挥发油;黄芩苷;正交试验

黄芩解毒颗粒由黄芩、鱼腥草、虎杖、辛夷等药材组成，具有清热解毒、清肺解表的功效，临床用于治疗由病毒感染等引起的疾病。为确定合理的提取工艺，保证制剂质量和疗效，以解热、抗炎药效为指标，对提取工艺路线进行初步筛选，根据筛选结果，确定提取工艺路线。提取工艺以鱼腥草、辛夷挥发油得量，君药黄芩中黄芩苷含有量和水提干浸膏得量为评价指标，采用正交试验设计法，确定本品的挥发油提取工艺和水提取的工艺条件。

1 实验仪器、动物与试药

1.1 仪器Agilent1100高效液相色谱仪、二极管阵列检测器、二元泵;Bp211D电子分析天平(德国);RE－52AA旋转蒸发器(上海);MYB型调温电热套(浙江);ZK－82A真空干燥箱(上海)。

1.2 动物SPF级NIH小鼠和SPF级SD大鼠(体质量为180～220 g)均由广东省实验动物中心购得。

1.3 试药黄芩苷对照品(批号:111595－200604)购于中国药品生物制品检定所;银翘解毒片(规格:0.52 g，佛山徳众药业有限公司，批号:11001);去痛片(规格:365 mg，湖北华中药业有限公司，批号:20101159);黄芩解毒颗粒所用药材均由广东养和医药有限公司购得，经笔者鉴定均符合2010年版《中国药典》一部各项下有关规定;所用化学试剂均为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 提取工艺路线的确定据文献［1－7］报道，处方中药材含有挥发油、黄酮、皂苷、生物碱和多糖等成分，根据各类成分的理化性质，按下列拟定的提取工艺方案制备供试品样品，并分别进行抗炎、解热药效学比较，确定本品的提取工艺路线。

2.1.1 方案1按处方比例称取处方各药材，分别加入药材量10倍水提取1次，每次2 h，滤过，提取液合并，浓缩成1 g浸膏含1.02 g药材的浸膏，作为样品1，备用。

2.1.2 方案2按处方比例，取鱼腥草、辛夷药材，照《中国药典》2010年版一部附录XD挥发油提取法，加入药材量10倍水提取挥发油，挥发油与药液另存，药渣加入其余处方量药材，分别加入药材量10倍量60%乙醇提取回流2次，每次2 h，滤过，提取液合并，加入提取挥发油后的药液，浓缩成1 g浸膏含0.97 g药材的浸膏，加入挥发油，作为样品2，备用。

2.1.3 方案3按处方比例，取鱼腥草、辛夷药材，照方案2挥发油提取方法提取挥发油，挥发油与药液另存，药渣加入其余药材，分别加10倍水提取2次，每次2 h，提取液合并，加入提取挥发油后的药液，浓缩成1 g浸膏含1.07 g药材的浸膏，加入挥发油，作为样品3，备用。

2.1.4 方案4按处方比例，取处方药材照方案3方法提取、浓缩成1 g浸膏约相当于1 g药材的浸膏，加入95%乙醇至药液含乙醇量为60%，静置24 h，滤过，上清液回收乙醇并浓缩成1 g浸膏含1.21 g药材的浸膏，加入挥发油，作为样品4，备用。

2.1.5 对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响［8］取SPF级NIH小鼠100只，随机分为对照组、银翘解毒片和各提取工艺样品高、中剂量组，每组10只，各给药组按剂量灌胃给药，对照组给予等体积蒸馏水，每天1次，共7 d，末次给药后1 h，每鼠右耳前后两面涂二甲苯0.04 mL，2 h后处死动物，剪取对称左右耳片，用8 mm打孔器沿左右耳郭相同部位打孔，分别迅速称质量，以两耳质量差为肿胀度指标，并以各组肿胀度的均值计算肿胀抑制率。结果见表1。

结果显示，各工艺样品对小鼠耳廓肿胀抑制率比较，以样品3最好。

2.1.6 对内毒素所致大鼠高热的影响［8］取SPF级SD大鼠若干，于室温(20±2)℃的实验室内饲养3 d后，每日测肛温2次，选一日内体温变化不超过0.4℃的大鼠120只，雌雄各半，随机分为正常对照组、模型对照组、银翘解毒片组、去痛片组和各提取工艺样品高、中剂量组，每组10只。各给药组按剂量灌胃给药，给药体积为10 mL/Kg，每天1次，连续5 d，对照组、模型对照组同法给予等体积的蒸馏水。末次给药前各组动物禁食不禁水24 h，末次给药30 min后，对照组腹腔注射生理盐水5 mL/Kg，其余各组大鼠均腹腔注射内毒素150 μg/Kg，注射容积5 mL/Kg，于致热攻击后1、2、4 h各测体温1次。结果见表2。

表1 不同工艺样品对抑制小鼠耳肿胀度的作用(±s，n=10)

表1 不同工艺样品对抑制小鼠耳肿胀度的作用(±s，n=10)

注:与对照组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

组别剂量/(g生药·kg－1)耳廓肿胀度/g肿胀抑制率/%对照组等体积15.550±4.85－银翘解毒片组0.8116.510±4.42＊＊58.14样品1高剂量组17.428.106±2.75*47.87样品1中剂量组8.719.002±3.16*42.11样品2高剂量组17.428.372±2.97*46.16样品2中剂量组8.7112.740±7.3218.07样品3高剂量组17.426.192±4.16＊＊60.18样品3中剂量组8.719.408±3.71*39.50样品4高剂量组17.428.745±3.47*43.76样品4中剂量组8.7110.263±4.99*34.00

表2 不同工艺样品对内毒素所致大鼠高热的影响(±s，n=10)

表2 不同工艺样品对内毒素所致大鼠高热的影响(±s，n=10)

注:与正常对照组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与模型对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

组别剂量/(g生药·kg－1)实验前大鼠体温/℃造模后不同时间大鼠体温/℃1 h2 h4 h正常对照组等体积37.49±0.2437.41±0.2837.52±0.3137.27±0.28模型对照组等体积37.29±0.2639.03±0.43＊＊39.48±0.49＊＊38.94±0.51＊＊银翘解毒片组0.56237.40±0.2938.55±1.1038.68±0.58##38.59±0.35样品1高剂量组13.5037.34±0.2338.87±0.3838.55±0.43##38.83±0.48样品1中剂量组6.7537.42±0.3238.55±0.4938.31±0.50##38.51±0.40样品2高剂量组13.5037.34±0.2238.42±0.3638.33±0.25##38.72±0.15样品2中剂量组6.7537.43±0.2538.66±0.4138.50±0.40##38.67±0.22样品3高剂量组13.5037.26±0.2038.04±0.49##38.07±0.25##38.65±0.29样品3中剂量组6.7537.17±0.1638.41±0.7238.34±0.56##38.78±0.21样品4高剂量组13.5037.39±0.3038.59±0.3638.42±0.30##38.72±0.27样品4中剂量组6.7537.32±0.3138.97±0.8138.49±0.60##38.66±0.44去痛片组0.5437.34±0.3038.02±0.41##37.76±0.26##38.27±0.37#

结果显示，与模型对照组比，各样品高、中剂量组2h和样品3提取物高剂量组1h均有明显的解热作用，其作用以样品3最好。

2.2 黄芩苷的测定方法［9］

2.2.1 色谱条件AgilentExteng XDB－C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)PN990967－902;流动相为甲醇－水－磷酸(47∶53∶0.2);柱温30℃;体积流量1.0 mL/min;检测波长280 nm。

2.2.2 对照品溶液的制备精密称取在60℃减压干燥4 h的黄芩苷对照品2.845 mg，至50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，即每1 mL含56.9 μg的溶液，即得。

2.2.3 标准曲线的绘制分别量取对照品溶液1、3、5、8、10、12 μL按上述条件进样，测得峰面积。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标作图，得标准曲线的回归方程为Y=2.815 324 8X+2.102 921，相关系数r=0.999 99。表明黄芩苷的量在56.9～682.8 ng之间范围内线性关系良好。

2.2.4 供试品溶液的制备精密移取水提取液4 mL，置50 mL量瓶中，加入76%乙醇定容，摇匀，静置24 h，精密量取上清液1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.5 测定方法分别精密吸取对照品溶液2 μL、10 μL和供试品溶液各5 μL注入液相色谱仪，测定，计算提取液中黄芩苷的含有量。

2.2.6 精密度试验精密吸取供试品溶液5 μL，按上述色谱条件重复进样6次，测得峰面积积分值RSD为0.48%。

2.2.7 稳定性试验分别精密吸取同一份供试品溶液5μL，分别于0、2、4、6、8、12 h按上述色谱条件进样，测得峰面积积分值RSD为0.46%。表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.2.8 重复性试验取同一浓缩液样品，分别按上述供试品溶液制备方法制备供试品溶液5份，按上述色谱条件进样5 μL，测得峰面积，计算含有量RSD为0.92%。

2.2.9 回收率试验取已知含有量浓缩液样品9份，分别精密加入一定量的黄芩苷对照品，按上述供试品制备与测定方法进行测定，计算黄芩苷检出量，测得黄芩苷平均回收率为98.06%，RSD为1.14%。

2.2.10 阴性对照试验按处方比例，称取除黄芩药材外的各味药材，分别加10倍水，煎煮两次，每次2 h，减压浓缩至500 mL，按上述供试品溶液的制备方法制备阴性供试品溶液。按上述方法测定，结果表明，阴性对照溶液在黄芩苷相应位置无吸收，处方中其它药味对本测定无干扰。

2.3 干浸膏量的测定精密吸取浓缩液50 mL，置已恒质量的蒸发皿中，水浴蒸干，照干燥失重测定法(《中国药典》2010年版一部附录IX G)测定，计算干浸膏质量。

2.4 挥发油提取工艺优选照《中国药典》2010年版一部附录ⅩD挥发油测定法甲法提取挥发油，以挥发油总质量为考察指标，对影响提取较大的浸泡时间、加水量和蒸馏时间进行考察研究，各因素水平见表3。

表3 挥发油提取因素水平

2.4.1 正交试验按处方比例，称取鱼腥草和辛夷药材9份，每份330 g，照L9(34)正交设计试验表安排试验，分取挥发油，加0.5 g无水硫酸钠脱水，过滤，用约5 mL乙醚洗涤容器及硫酸钠，挥发油转移至已恒质量的称量瓶中，40℃挥干乙醚，称质量，结果见表4、表5。

结果表明:因素A和因素C对实验结果影响显著，各因素的主次顺序为C＞A＞B，C因素2、3水平间无显著差别，最优提取工艺确定为药材加12倍水，回流提取6 h;即A2B1C2。

表4 挥发油提取工艺正交实验结果

表5 方差分析

2.4.2 验证试验按处方比例取鱼腥草、辛夷药材，共3份，按优选的工艺条件提取挥发油。3次试验挥发油得率分别为0.179%、0.176%、0.176%，平均0.177%，表明该工艺稳定可行，重复性好。

2.5 水提取工艺优选以黄芩苷含有量和干浸膏得量的综合评分值为指标，对影响药材水提取的加水量、煎煮时间和煎煮次数进行考察研究，因素水平见表6。

表6 因素水平

2.5.1 正交试验按处方比例，称取黄芩等药材9份，每份204 g，按正交实验表L9(34)安排试验。滤过，提取液合并，浓缩并定容至500 mL，既得。测定干浸膏得量(X1)和黄芩苷含有量(X2)。按公式Y=［(X1i/X1max)×0.4+(X2i/X2max)×0.6)］×100计算综合评分值，以综合评分值计算正交试验结果，并进行方差分析，结果见表7、表8。

结果表明，因素主次为提取次数(C)＞加水量(A)＞提取时间(B)。因素C和因素A对试验结果有影响。最佳工艺为:分别加药材量8倍水提取3次，每次1 h，即A2B1C3。

2.5.2 验证试验按最佳水提取工艺条件重复试验3次，结果表明，平均干浸膏得率为26.58%，RSD为1.10%。黄芩苷平均质量浓度为7.518 mg/mL，RSD为1.89%。计算黄芩苷的平均提取率为87.65%(处方中黄芩药材含黄芩苷总量为4 285.8mg)，平均综合评分值为98.33，与正交试验综合评分最大值之间接近，表明该工艺合理、稳定、可靠。

表7 正交设计试验结果

表8 方差分析

3 讨论

3.1 中药复方成分复杂，其效应物质基础是复方所含的全成分［10］，同一处方不同提取工艺所产生效应物质之间的比例不同，产生药效作用的强弱也不相同。药效试验结果表明，本方提取工艺路线以挥发油提取优于不提取工艺，水提取优于醇提取或水提醇沉工艺，提示，处方中挥发油为有效成分之一，多糖类等醇中溶解度低的物质可能也是有效成分之一。

3.2 黄芩为方中君药，选用黄芩苷作为提取评价指标之一，分析方法成熟，分析结果可靠。经挥发油提取和水提取工艺验证表明，优化的工艺参数稳定、可靠、有效，为本制剂的下一步研究奠定了良好的基础。

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R284.2

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1001－1528(2012)10－2028－04

2012－04－21

王洛临(1958—)，男，主任中药师，从事中药新药研发与工艺研究。Tel:(020)83501292，E－mail:luolin_w@163.com