RP-HPLC法同时测定四季三黄片中5种指标成分

张海红，王树，张丹参，薛贵平

(河北北方学院药学系，河北 张家口 075000)

RP-HPLC法同时测定四季三黄片中5种指标成分

张海红，王树，张丹参，薛贵平

(河北北方学院药学系，河北 张家口 075000)

目的建立RP－HPLC法同时测定四季三黄片(大黄、黄芩、栀子、黄柏)中栀子苷、盐酸小檗碱、黄芩苷、大黄素和大黄酚的方法。方法采用Thermo－C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm);流动相为甲醇－0.1%磷酸水溶液，采用梯度洗脱，检测波长分别为240 nm、345 nm、278 nm、254 nm;体积流量1.0 mL/min。结果栀子苷、盐酸小檗碱、黄芩苷、大黄素和大黄酚的线性范围分别为:6～60 μg/mL、5.4～54 μg/mL、5.3～53 μg/mL、4.3～43 μg/mL、5.8～58 μg/mL(0.999 7＜r＜0.999 9)，平均回收率在98.0%和102%之间。结论该法检测效率高，专属性强，重复性好，可用于四季三黄片中栀子苷、盐酸小檗碱、黄芩苷、大黄素和大黄酚的定量测定。

RP－HPLC;四季三黄片;栀子苷;盐酸小檗碱;黄芩苷;大黄素;大黄酚

四季三黄片是由大黄、黄芩、栀子、黄柏加工而成的中药复方制剂，具有消炎退热、通便利水功效，用于治疗口鼻生疮、咽疼牙痛、口干舌燥、目眩头晕、大便秘结、小便赤黄［1］。有报道［2－7］测定了其中的某一种或两种成分，也有采用薄层色谱等方法控制其质量的报道［8－9］，但同时测定四季三黄片中5种成分的方法尚未见报道。根据中医理论，复方中药药效的发挥是各药味多种组分共同作用的结果，它们含有量的多少及比例关系会影响其疗效［10－11］，使用HPLC同时测定药物中多种有效成分的方法也受到了越来越多的关注［12］。为了更好的控制四季三黄片的内在质量，保证临床用药的安全、有效，本实验以栀子苷、盐酸小檗碱、黄芩苷、大黄素和大黄酚作为四季三黄片的质控指标，采用多波长RP－HPLC法对5个成分进行同时测定。

1 仪器与试药

1.1 仪器Waters600高效液相色谱仪，Empower化学工作站，2996 DAD检测器(美国waters公司);KS—6000超声波清洗机(宁波科生仪器厂)。

1.2 试药栀子苷(110749－200714)、黄芩苷(110715－200212)、盐酸小檗碱(110713－200911)、大黄素(110756－200110)和大黄酚(110796－200310)均购于中国药品生物制品检定所;四季三黄片(江西华太药业，批号090623，090712，100722);甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件Thermo－C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm);流动相为A甲醇－B 0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱程序为0～5 min(40%A，直线)，5～10 min(60%A，线性)，10～20 min(80%A，线性)，20～35 min(90%A，线性)，35～45 min(90%A，直线);检测波长为240 nm(栀子苷)、345 nm(盐酸小檗碱)、278 nm(黄芩苷)、254 nm(大黄素和大黄酚);体积流量1.0 mL/min，进样量20 μL。在该条件下样品中各待测组分分离度符合要求(R＞1.5)，栀子苷、盐酸小檗碱、黄芩苷、大黄素和大黄酚的保留时间分别约为7.9、14.8、18.0、36.9、40.1 min。混合对照品溶液、样品溶液及各阴性对照溶液HPLC图见图1～4。

图1 240 nm处的HPLC图Fig.1 HPLC chromatograms at 240 nm

2.2 混合对照品溶液及供试品溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备精密称取栀子苷6.0 mg、盐酸小檗碱5.4 mg、黄芩苷5.3 mg、大黄素4.3 mg和大黄酚5.8 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解，定容，栀子苷、盐酸小檗碱、黄芩苷、大黄素和大黄酚质量浓度分别为120、108、106、86、116 μg/mL，作为混合对照品贮备液，精密量取上述贮备液2 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻线，摇匀，制成质量浓度分别为24、21.6、21.2、17.2、23.2 μg/mL的栀子苷、盐酸

图2 345 nm处的HPLC图Fig.2 HPLC chromatograms at 345 nm

图3 278 nm处的HPLC图Fig.3 HPLC chromatograms at 278 nm

2.2.2 供试品溶液的制备取四季三黄片10片，去包衣后研细，取细粉约0.3 g，精密称定后置具塞锥形瓶中，加入25mL甲醇，称定质量，50℃超声30 min取出，放冷，称质量，加甲醇补足减失质量，滤过，取滤液2 mL置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻线，摇匀作为供试品溶液。

2.3 精密度试验取2.2项下混合对照品溶液，在2.1项色谱条件下重复进样5次，记录峰面积，计算栀子苷、盐酸小檗碱、黄芩苷、大黄素和大黄酚的色谱峰面积，其RSD值分别为1.2%、0.8%、0.9%、1.0%、1.3%(n=5)，结果表明精密度良好。

2.4 重复性试验取同一批四季三黄片(批号090712)5份，精密称定，按2.2项下方法制备供试品溶液，在2.1项色谱条件下平行测定，计算含有量，栀子苷、盐酸小檗碱、黄芩苷、大黄素和大黄酚含有量的RSD值分别为1.4%、1.1%、0.9%、1.2%、1.2%，表明方法的重复性良好。

2.5 稳定性试验取同一样品溶液在12 h内间隔2 h进样测定，记录峰面积，计算栀子苷、盐酸小檗碱、黄芩苷、大黄素和大黄酚色谱峰的峰面积的RSD值分别为1.3%、1.0%、0.9%、1.4%、小檗碱、黄芩苷、大黄素和大黄酚混合对照品溶液。1.7%(n=5)，表明样品溶液在12 h内稳定。

图4 254 nm 处的HPLC图Fig.4 HPLC chromatograms at 254 nm

2.6 线性试验精密量取2.2项下的混合对照品贮备液0.5、1、2、3、4、5 mL置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度制成系列质量浓度的溶液，在2.1项色谱条件下测定，记录峰面积。以质量浓度为横坐标(C)，峰面积为纵坐标(A)，进行线性回归，结果见表1。

表1 5种指标成分的线性关系Tab.1 Regression equations of five compositions

2.7 加样回收率试验取已知栀子苷、盐酸小檗碱、黄芩苷、大黄素和大黄酚含有量的同一批样品(批号090712)6份，每份约0.1g，精密称定后置25mL量瓶中，各加入混合对照品贮备液2 mL，甲醇定容至刻度，滤过，按2.1项下的方法进样，测定含有量，计算回收率。结果栀子苷、盐酸小檗碱、黄芩苷、大黄素和大黄酚的平均回收率分别为98.2%，98.0%，102%，101%，99.7%，RSD分别为1.4%，1.0%，1.7%，0.8%，1.0%(n=6)，符合要求。

2.8 样品测定取四季三黄片10片，去包衣后研细，取细粉约0.3 g，按照2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下的方法进样测定，每份样品测3次，测定3批样品，代入回归方程计算各成分质量分数，结果见表2。

表2 四季三黄片样品测定结果(n=3)Tab.2 Results of assay for different batches of Siji Sanhuang Tablets(n=3)

3 讨论

3.1 四季三黄片中栀子苷、盐酸小檗碱、黄芩苷、大黄素和大黄酚5种指标成分最大吸收波长不同，经全自动紫外可见分光光度计检测栀子苷的最大吸收波长为240 nm，盐酸小檗碱的最大吸收波长为345 nm，黄芩苷的最大吸收波长为278 nm，大黄素和大黄酚的最大吸收波长为254 nm附近有较强吸收，为保证各指标成分都有较好的灵敏度并减少干扰，实验中选用多波长法，使不同化合物在各自最大吸收波长下测定，以获得最佳的检测效果。

3.2 文献报道［2－8］四季三黄片的定量测定方法很多，但在同一色谱条件下实现栀子苷、盐酸小檗碱、黄芩苷、大黄素和大黄酚5种组分同时定量测定的方法尚未见报道，本实验采用梯度洗脱，可一次进样同时检测上述5种成分，检测效率高，且精密度、重复性等方法学考察均符合要求，该法可用于四季三黄片的质量控制。

［1］中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准:中药成方制剂第二十册［S］.1998:67.

［2］冯看，杨黎.HPLC测定四季三黄片中大黄素和大黄酚的含量［J］.广西中医学院学报，2008，11(2):50－52.

［3］许江红，张若良.HPLC法测定四季三黄片中黄芩苷的含量［J］.江西中医学院学报，2006，18(6):12.

［4］黄淑彰.RP－HPLC法测定四季三黄片中栀子苷的含量［J］.广西中医药，2004，27(4):53－54.

［5］吴晓勇，许江红，张若良.高效液相色谱法测定四季三黄片中盐酸小檗碱含量［J］.中国药业，2010，19(16):32

［6］彭文，刘兆雄.四季三黄片中黄芩苷和盐酸小檗碱含量的同时测定［J］.中国药业，2011，20(17):35－36

［7］邬晓鸥，毛筑梅，肖丽和，等.多波长高效液相色谱法测定四季三黄胶囊中4种主药成分含量［J］.天津药学，2004，16(3):5－8

［8］宋文焕.四季三黄片和四季三黄丸薄层色谱分析［J］.中国中药杂志，2002，27(9):713

［9］卞艳晶，高延甲，王建.四季三黄片质量控制方法的研究［J］.齐鲁药事，2010，29(1):20－22

［10］李艳荣，蒋晔，郝福，等.RP－HPLC快速测定清胃黄连片中4种指标成分的含量［J］.中国中药杂志，2007，32(24):2597－2600

［11］李艳荣，蒋晔，郝福，等.RP－HPLC同时测定功劳去火片中栀子苷、黄芩苷及盐酸小檗碱的含量［J］.中成药，2006，28(8):1126－1129

［12］祝忠民，卢晓荣.HPLC法同时测定三黄片中4种成分的含量［J］.西北药学杂志，2008，23(5):300－301

Determination of five components in Siji Sanhuang Tablets by RP-HPLC

ZHANG Hai－hong，WANG Shu，ZHANG Dan－shen，XUE Gui－ping
(Hebei North University，Zhangjiakou 075000，China)

AIMTo establish a method for simultaneously determining geniposide，berberine hydrochloride，baicalin，emodin and chrysophanol in Siji Sanhuang Tablets(Rhei Radix et Rhizoma，Scutellariae Radix，Gardeniae Fructus，Phellodendri Chinensis Cortex).METHODSThe separation was performed on a thermo－C18column(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)with gradient elution using methanol and water(contained 0.1%H3PO4)as mobile phase.The detection wavelengths were 240 nm，345 nm，278 nm and 254 nm，respectively.RESULTSLinear ranges of geniposide，berberine hydrochloride，baicalin，emodin and chrysophanol concentrations were 6－60μg/mL，5.4－54 μg/mL，5.3－53 μg/mL，4.3－43 μg/mL，5.8－58 μg/mL(0.999 7＜r＜0.999 9)，respectively.Their average recoveries fell between 98.0%and 102%.CONCLUSIONThe RP－HPLC method established in this experiment can be used to determine the contents of geniposide，berberine hydrochloride，baicalin，emodin and chrysophanol in Siji Sanhuang Tablets.The method can also be used as the standard for the quality control of Siji Sanhuang Tablets.

RP－HPLC;Siji Sanhuang Tablets;geniposide;berberine hydrochloride;baicalin;emodin;chrysophanol

R927.2

A

1001－1528(2012)10－1915－04

2012－01－20

张家口市科学技术研究与发展指导计划项目(1021097D)

张海红(1981—)，女，讲师，硕士，研究方向:中药药代动力学。E－mail:zhanghaihongzhh@163.com