不同品种红枣中三萜酸及环核苷酸的测定

高 娅， 杨 洁， 杨迎春， 苏力坦·阿巴白克力

(新疆大学生命科学与技术学院，新疆乌鲁木齐830046)

红枣Zizyphus Jujube Date为鼠李科枣属植物枣树Zizyphus Jujube Mill的成熟果实，是卫生部批准的药食兼用品种之一［1］。红枣中含有的三萜酸类物质所表现出的细胞毒性，具有对肿瘤细胞高度选择性的特点，成为近年来抗肿瘤药物研究的热点。现代药理学研究表明，白桦脂酸 (betulinic acid，BA)、齐墩果酸 (oleanolic acid，OA)和熊果酸(ursolic acid，UA)为红枣中最具代表性且含有量较高的五环三萜类化合物，九十年代中期经研究发现白桦脂酸可以选择性地杀死人类黑色素瘤细胞而不杀伤健康细胞，白桦脂酸对HIV-1型感染有抑制作用，另外近期的研究表明白桦脂酸对脑瘤、神经外胚层瘤、白血病等恶性肿瘤细胞也有抑制作用;齐墩果酸具有较强的抗菌消炎作用及保护肝脏、利水渗湿等功效;熊果酸有抑制多种恶性肿瘤细胞生长的作用，对诱癌、致癌物也有一定的抵抗作用，毒副作用小，安全性高［2］。

环核苷酸及其衍生物有10多种，其中具重要生物活性的主要为环磷酸腺苷 (adenosine 3'，5'-cyclic monophos-phate，cAMP)和环磷酸鸟苷(guanosine-3'，5'-cyclic phosohate，cGMP)。在人与哺乳动物体内，环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷已被公认为两种具有反向调节作用的第二信使物质，共同参与多种生理生化过程的调节，并可用于基因转录，影响蛋白质合成。医学研究证明至少40多种疾病 (包括癌症、高血压、冠心病、心肌梗塞和心源性休克等重大疾病)与环核苷酸的代谢有关。据报道，枣成熟果肉中环磷酸腺苷含有量是所有已测动植物材料中最高的，颇具开发价值［3］。

单独测定白桦脂酸、齐墩果酸、熊果酸、环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷的文献已有不少，检测方法过去多采用纸层析法、薄层层析法、紫外分光光度法、竞争蛋白法等，这些方法存在着所需时间长、操作繁琐、重现性差、灵敏度低、人为误差比较大等问题，现在多采用高效液相色谱法 (HPLC法)进行定量测定。现代研究表明，不同品种、不同产地的药材，其所含化学成分的种类及量均有较大差异，因此有必要开展不同品种、不同产地红枣中三萜类化合物和环核苷酸含有量的考察，建立快速、准确、高效的检测方法，有助于指导白桦脂酸、齐墩果酸、熊果酸和环核苷酸加工时选择合适的原料，这对红枣进行深加工，带动当地经济，增加农民收入将起到积极的作用。

1 仪器与试剂

LC—10Atvp高效液相色谱仪 (紫外检测器)(日本岛津公司);AL104型电子天平 (梅特勒-托利多国际股份有限公司);NW Ultra-pure Water System超纯水仪 (力康生物医疗科技控股有限公司);KQ—250DE型数控超声波仪 (昆山市超声仪器有限公司)。

对照品:白桦脂酸 (上海源叶生物科技有限公司，批号:YY90277)，齐墩果酸 (中国药品生物制品检定所，批号 110709-200505)，熊果酸(中国药品生物制品检定所，批号110742-200516)，环磷酸腺苷 (中国药品生物制品检定所，批号140709-200401)，环磷酸鸟苷 (美国Sigma公司)。

甲醇 (色谱纯，美国 fisher scientific公司)，实验用水为超纯水，磷酸、磷酸二氢钾等其余试剂均为分析纯。

新郑红枣、金丝小枣、狗头枣、滩枣购自新疆乌鲁木齐七一酱园超市，其它品种采自新疆和田、阿克苏、喀什、若羌、哈密，样品采集后，晾干，去核，粉碎后过40目筛，备用。

2 方法与结果

2.1 白桦脂酸、齐墩果酸和熊果酸的测定

2.1.1 色谱条件 Shim-pack VP-ODS C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm);流动相为甲醇-0.2%磷酸水溶液 (90∶10，V/V);检测波长210 nm;体积流量0.5 mL/min;柱温为室温;进样量20 μL。

2.1.2 三萜酸标准贮备液的制备 分别准确称取白桦脂酸、齐墩果酸、熊果酸各5.00 mg，加少量甲醇溶解，移入50 mL量瓶中，用甲醇定容至50 mL，分别得到质量浓度为0.1 mg/mL的白桦脂酸、齐墩果酸和熊果酸的标准贮备溶液。

2.1.3 样品前处理 准确称取5.0 g红枣粉，加入25 mL甲醇，70℃超声提取20 min，过滤，滤渣再加入20 mL甲醇重复提取1次，过滤，合并两次滤液并定容至50 mL，4000 r/min离心10 min，上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤后备用。

2.1.4 标准曲线与线性范围 分别量取2.1.2项白桦脂酸、齐墩果酸和熊果酸标准贮备液2.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 mL至 100 mL量瓶，用甲醇定容，分别得到质量浓度为2.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg/mL 的系列标准溶液，分别进样20 μL，按2.1.1项色谱条件进行测定。以峰面积Y对质量浓度C进行线性回归，得回归方程，结果见表1。

表1 回归方程和相关系数Tab.1 Linear equations and their correlation coefficients

2.1.5 系统适用性实验 取对照品溶液、供试品溶液，按2.1.1项色谱条件测定，记录色谱图 (图1)。结果对照品和供试品溶液的色谱图中，白桦脂酸、齐墩果酸和熊果酸的保留时间一致。经计算，理论塔板数、分离度、拖尾因子等各项指标均符合《中国药典》2005年版一部附录VID关于系统适用性的规定。

2.2 环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷的测定

2.2.1 色谱条件 Shim-pack VP-ODS C18色谱柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相为甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢钾 (10∶90，V/V);检测波长254 nm;体积流量0.8 mL/min;柱温为室温;进样量 20 μL。

图1 对照品 (A)和样品溶液 (B)的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substance solution(A)and sample solution(B)

2.2.2 cAMP和cGMP标准贮备液的制备 分别准确称取 cAMP、cGMP各5.00 mg，加入2 mL超纯水溶解，摇匀，定容于5 mL量瓶中，即得质量浓度均为1.0 mg/mL的cAMP、cGMP标准贮备液。

2.2.3 样品前处理 准确称取5.0 g红枣粉，加入25 mL超纯水，70℃超声提取30 min，过滤，滤渣再加入20 mL超纯水重复提取1次，过滤，合并两次滤液并定容至50 mL，8000 r/min离心15 min，上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤后备用。

2.2.4 标准曲线与线性范围 分别精密量取2.2.2项的cAMP、cGMP标准贮备液0.05、0.10、0.20、0.50、1.0、5.0、10.0 mL至100 mL量瓶，用甲醇定容，分别得到质量浓度为 0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、50.0、100.0 μg/mL的系列标准溶液，分别进样20 μL，按2.2.1项色谱条件进行测定。以峰面积Y对质量浓度C进行线性回归，回归方程和线性范围见表1。

2.2.5 系统适用性实验 取对照品溶液、供试品溶液，按2.2.1项色谱条件测定，记录色谱图 (图2)。结果对照品和供试品溶液的色谱图中，环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷的保留时间一致。经计算，理论塔板数、分离度、拖尾因子等各项指标均符合《中国药典》2010年版一部附录VID关于系统适用性的规定。

2.3 精密度实验 分别吸取白桦脂酸、齐墩果酸和熊果酸及环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷混合标准贮备液各20 μL，按2.1.1项和2.2.1项色谱条件连续进样5次，分别以白桦脂酸、齐墩果酸、熊果酸、环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷的峰面积计算，相对标准偏差 (RSD)依次为 1.41%、1.24%、1.08%、0.94%和1.43%(n=5)，表明仪器进样精密度良好。

2.4 重复性实验 准确称取5份同一批红枣粉5.0 g，按2.1.3项和2.2.3项方法制备样品溶液并进行测定，分别计算白桦脂酸、齐墩果酸、熊果酸、环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷，RSD分别为1.9%、1.8%、1.9%、1.8%和 0.9% (n=5)，表明方法的重现性良好。

图2 混合对照品 (C)和样品溶液 (D)的HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of mixed reference substancs solution(C)and sample solution(D)

2.5 稳定性实验 取同一批红枣样品溶液，每隔1 h进样1次，共进样8次，测定各时间点下白桦脂酸、齐墩果酸、熊果酸、环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷峰面积及RSD值。结果，白桦脂酸、齐墩果酸、熊果酸、环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷峰面积的RSD分别为 2.1%、2.3%、2.1%、1.5%和 2.0%(n=8)，表明样品溶液至少在8 h内稳定。

2.6 回收率实验 准确称取红枣粉5.0 g，按2.1.3项和2.2.3项处理样品，分别加入不同浓度的白桦脂酸、齐墩果酸、熊果酸、环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷标准贮备液，按2.1.1项和2.2.1项色谱条件分别进样测定，计算回收率。结果见表2。

2.7 样品测定 取不同产地的红枣粉，按2.1.3项和2.2.3项制备方法和2.1.1项和2.2.1项色谱条件分别进样测定，以外标法计算，结果见表3。

3 结论

通过SPSS 17.0软件对所得数据进行均值方差分析，从所测定的15个样品红枣中可以看出，不同品种、不同产地红枣中白桦脂酸、齐墩果酸、熊果酸、环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷的含有量均存在显著性差异 (P＜0.05)，以开发枣三萜酸和环核苷酸为目的的功能性食品和保健品应该注意枣品种的选择。在所测定的15个样品中，河南新郑红枣中白桦脂酸和齐墩果酸含有量最高，为632.83 μg/g和202.10 μg/g;山东金丝小枣和和田骏枣中齐墩果酸的含有量之间差异不显著 (P＜0.05)，但与其它品种间均存在显著性差异;河北沧州金丝小枣中熊果酸含有量最高，为374.23 μg/g;阿克苏骏枣中环磷酸腺苷含有量最高，为285.44 μg/g;和田骏枣中环磷酸鸟苷含有量最高，为56.63 μg/g。

表2 加样回收率试验结果(n=6)Tab.2 Results of recovery experiments(n=6)

表3 不同产地红枣粉中白桦脂酸、齐墩果酸、熊果酸、环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷的测定结果Tab.3 Contents of BA、OA、UA、cAMP and cGMP in Jujube of different cultivars

同一产地不同品种间5种成分的含有量也存在显著性差异，如阿克苏骏枣中5种成分的含有量均高于灰枣和金昌一号;即使是同一品种，由于地域的不同，受环境影响，5种成分的含有量也有明显差异，如灰枣中，喀什泽普县的含有量均高于阿克苏和若羌地区，为阿克苏灰枣含有量的2.23倍。同一品种不同等级之间也存在显著性差异，如若羌红枣，且次级枣中环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷的含有量均高于优级枣，此结论与文献 ［3］报道一致。

所测3种三萜酸在各品种之间的基本规律是白桦脂酸含有量最高，其次为熊果酸，再次为齐墩果酸。环磷酸腺苷的含有量明显高于环磷酸鸟苷。

4 讨论

目前，关于HPLC法测定白桦脂酸、齐墩果酸、熊果酸、环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷已有报道，根据已有资料表明检测三萜酸的流动相多数为甲醇-水-酸或者乙腈-水-酸。由于三萜酸类化合物呈弱酸性，在中性或碱性条件下易电离，因此分别采用磷酸盐体系、磷酸、冰醋酸调整流动相的酸碱性。通过对流动相分离条件进行选择后发现，等度洗脱的分离效果并不亚于梯度洗脱方式，冰醋酸本身具有洗脱能力，磷酸廉价易得且分离效果较好，考虑到实验成本等因素，最终选择甲醇-水体系，并用磷酸调节流动相的酸碱性，恒梯度洗脱方式。

王向红［3］等从阜平大枣不同等级样品分析结果来看，齐墩果酸和熊果酸的含有量似乎与品质之间不存在明显相关性，本研究通过对新疆若羌灰枣不同等级样品中白桦脂酸、齐墩果酸和熊果酸含有量进行分析，其结论与本研究结果一致。

郜文等［6］测定陕西省红枣中 cAMP含有量为62.9 μg/g，与本次测得陕西狗头枣 (80.91 μg/g)的结果差异不大;王向红［3］等曾对10余个枣品种中cAMP和cGMP含有量进行测定，结果表明骏枣中cAMP的含有量明显高于其它品种，与本研究结果一致，其中三变红枣中cGMP含有量最高，为17.2 μg/g，其次为婆婆枣，其它枣品种的含有量约在0.63 μg/g～3.44 μg/g之间，本研究几个其它省区枣品种的含有量均符合此范围，但新疆枣品种cGMP的含有量明显高于其它几个省区，和田骏枣含有量最高，为56.63 μg/g;苏豫梅等［5］测定新疆阿克苏灰枣和骏枣中cAMP含有量分别为170 μg/g与260 μg/g，与本实验结果有差异，初步分析其原因可能与不同的采样时间、采样地点、提取方法等有关，对于这些影响因素还有待于进一步的研究。

本研究对15种红枣中3种三萜酸及环核苷酸活性成分进行了测定，对于提高枣及枣类产品的附加值、选育高三萜酸含有量和高环核苷酸含有量枣品种以及开发枣的功能食品和保健品都具有重要意义。

［1］曹艳萍，杨秀利，薛成虎.红枣中齐墩果酸提取工艺的研究［J］.食品科学，2007，28(10):165-167.

［2］盛灵慧，高运华，赵正宜.固相萃取-HPLC测定枣中熊果酸和齐墩果酸［J］.化学分析计量，2008，17(4):18-20.

［3］王向红，桑亚新，刘孟军.高效液相色谱法测定枣果中的环核苷酸［J］.中国食品学报，2005，5(3):108-112.

［4］李 明，杨国林，李明润，等.大枣环磷酸腺苷提取工艺的研究［J］.中药材，2007，30(9):1143-1145.

［5］ 苏豫梅，许 玲，孙振荣，等.用HPLC法测定红枣中cAMPA含量的研究［J］.农产品加工，2011，7:76-78.

［6］郜 文，丁兆毅，徐 菲，等.HPLC法测定大枣环磷酸腺苷的含量［J］.首都医科大学学报，2011，32(3):375-378

［7］王立霞，陈锦屏，段玉峰，等.和田玉枣中环磷酸腺苷的分离纯化工艺研究［J］.食品科学，2008，29(12):250-254.

［8］Subbaramaish k.UrsoLic acid ingibits cycLooxygenase-2 transcroption in human mammary epitheLiaL ceLLs［J］.Cancer Res，2000，60(9):2399.

［9］Liu Jie.Pharmacology of oleanolic and ursolic acid［J］.Ethnophannacol，1995，49:57.

［10］李 东，何 伶.高效液相色谱-蒸发光散射检测法同时测定木瓜中齐墩果酸和熊果酸含量［J］.中国医药学院杂志，2005，25(3):259-261.

［11］樊 君，高续春，郭 璞，等.大孔吸附树脂分离纯化枣渣中三萜酸的研究［J］.离子交换与吸附，2008，24(5):426-433.

［12］Hanabasa K，Cyong J，Takahashi M.High-level of Cyclic AMP in the jujube plum［J］.Planla med，1981，42(8):380-384.

［13］DanieL P B，Wallker W H，Habener J F.Cyclic AMP signaling and gene regulation［J］.Annu Rev Nutr，1998，18:353-383.

［14］Cyong J C，Takahashi M.Identification of guanosine 3'，5'-monophosphate in the fruit of Zizyphus Jujube［J］.Phytochemistry，1982，21:1871-1874.

［15］王向红，崔 同，齐小菊，等.HPLC法测定不同品种枣及酸枣中的齐墩果酸和熊果酸［J］.食品科学，2002，23(6):137-138.

［16］谢 乐，马晓黎，刘丽芳，等.HPLC测定不同产地威灵仙中齐墩果酸的含量［J］.中成药，2009，31(1):100-103.

［17］张 岩，吕 品，刘敬泽，等.高效液相色谱法同时测定浓缩枣汁中环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷的含量［J］.食品科学，2009，30(18):321-322.

［18］于明明，周富强，刘军海.熊果酸提取工艺的研究进展［J］.氨基酸和生物资源，2009，31(1):33-36.