甘蔗丝氨酸/苏氨酸激酶基因的克隆及序列分析

陈 玲，叶冰莹，黄贞杰，张积森，陈由强，陈如凯

(1.福建师范大学生命科学学院，福建 福州 350108;2.农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室，福建 福州 350108;3.发育与神经生物学福建省高等学校重点实验室，福建 福州 350108)

甘蔗(Saccharum officinarum L.)是最主要的糖料作物，蔗糖已占我国食糖总产量的90%;同时也是生产乙醇的理想能源作物[1，2]。因此，研究与糖代谢相关的信号通路具有重要意义。生物体内普遍存在的信息转导调节方式是蛋白激酶(protein kinase，PK)和蛋白磷酸酶(protein phosphatase)催化蛋白质磷酸化与去磷酸化，这一过程几乎涉及所有的生理及病理过程，如糖代谢、光合作用、细胞的生长发育、基因表达、神经递质的合成与释放，甚至癌变等，在细胞信号转导过程中占有极其重要的位置[3]。蛋白激酶可能在酶活的调控、基因表达和细胞分化方面有一定作用，将激素、代谢和发育信号转导路径相联系[4]。属于蛋白激酶的丝氨酸/苏氨酸激酶(serine/threonine kinase，STK)在植物的生长、转化、基质形成及凋亡的生理过程中起着重要作用[5]，通过催化糖代谢中相关酶的磷酸化与去磷酸化，从而影响甘蔗的糖分积累。

基因克隆是分子生物学的起点，要研究基因的结构或者是功能都必须先获得相应的基因序列[6]。本研究从甘蔗中克隆获得STK基因cDNA片段，并在此基础上采用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends，RACE)扩增甘蔗STK基因cDNA的5'及3'端序列，从而为甘蔗STK的分子生物学研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 甘蔗品种FN 28由甘蔗生理生态与遗传改良重点开放实验室育种组提供。

1.1.2 试剂 Trizol购自Invitrogen;焦碳酸二乙酯(DEPC)购自Sigma;PrimeScriptTMRT-PCR Kit、TaKaRa Ex Taq酶、EcoRⅠ购自TaKaRa;羧苄青霉素Carb购自上海生物工程公司;SV Gel and PCR Clean-Up System购自Promega;SMARTTMRACE cDNA Amplification kit购自Clontech。

1.1.3 菌种与转化质粒 大肠杆菌DH5α由本实验室保存，pMD-19T载体购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 甘蔗STK基因cDNA片段的克隆 (1)PCR引物设计。以NCBI登录号为 EC277889.1的玉米序列为种子序列，利用甘蔗EST数据库筛选同源序列并进行拼接，根据拼接序列设计上下游电子克隆引物。STK1上游:5'CGATGAAGATACCCAAGTACCAGACACC3';STK2下游:5'TACAAGAGGAGGGAGAGAAGCGAAGC 3'。(2)甘蔗叶与茎总RNA的提取及cDNA的合成。根据Trizol说明书提取蔗叶和茎的总RNA，cDNA合成应用PrimeScriptTM1st strand cDNA synthesis Kit。(3)甘蔗STK cDNA的克隆及序列分析。PCR反应条件为:94℃预变性5 min后，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环，72℃延伸7 min。反应总体积为 50 μL，含 ddH2O 33.5 μL，Ex Buffer 5 μL，dNTP 4 μL，引物 STK1、STK2 各 1 μL，模板cDNA第一链5 μL，Ex Taq DNA聚合酶0.5 μL。序列分析采用GenBank数据库Blast在线分析软件及DNAMAN等软件。

1.2.2 甘蔗STK基因cDNA的5'UTR及3'UTR的扩增 (1)引物设计:根据已克隆得到的STK基因cDNA序列设计相应引物。5'-RACE引物R5为:5'TGTCCCATCAGCACAGTAACCAAGCAAC 3';3'-RACE引物R3为:5'AATATCCAGGACACCATCCAGCAAGGGC 3'。

(2)PCR反应条件为:94℃预变性5 min后，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环，72℃延伸7 min。反应总体积为 20 μL，含 ddH2O 11 μL，Ex Buffer 2 μL，dNTP 1.6 μL，上游引物 R5 或 R3(4 μmol·L-1)、下游引物 UPM(通用接头引物)各2 μL，模板 cDNA 第一链1 μL，Ex Taq DNA 聚合酶0.4 μL。序列分析采用GenBank数据库Blast在线分析软件及DNAMAN等软件。

2 结果与分析

2.1 甘蔗叶与茎总RNA提取

本研究所提取的蔗茎与蔗叶总 RNA 浓度如下:C(茎)=565 μg·mL-1，D260nm/280nm(茎)=2.07，D260nm/230nm(茎)=2.10;C(叶)=1154 μg·mL-1，D260nm/280nm(叶)=2.03，D260nm/230nm(叶)=2.18，完整性较好，蛋白质和多糖含量较少，具有较高的纯度，符合合成cDNA以及RACE的要求(图1)。

2.2 甘蔗STK cDNA的克隆

从图2可见，PCR扩增出了约1092 bp的基因片段，条带单一、清晰。菌液PCR后用EcoRⅠ进行单酶切鉴定，载体pMD-19T大小为2692 bp，目的片段约1092 bp，重组质粒约3800 bp，用EcoRⅠ酶切后条带大小与理论相符(图3)。

2.3 PCR扩增5'UTR及3'UTR

5'RACE PCR扩增出了约800 bp的基因片段(图4)，3'RACE PCR扩增出了约1000 bp的基因片段(图5)。

2.4 序列分析

5'、3'端序列与中间片段重叠延伸后总片段长为1133 bp，其中5'UTR为54 bp，3'UTR为254 bp，包含完整的ORF(825 bp)，共编码274个氨基酸(图6)。Open Reading Frame Finder确定其为丝氨酸/苏氨酸激酶，已将此序列上传 NCBI，GeneBank登录号为 JX105518。通过预测(∥cn.expasy.org/too1s)，该蛋白质分子质量为 29.9052 ku，理论等电点为 6.36。

图1 RNA电泳图Fig.1 RNA electrophoretogram

将测序结果与NCBI的数据库进行BLAST同源性比对，选取同源性较高的植物进行系统发育树的分析，并借助软件ClustalX 1.83及BioEdit进行序列之间的比对，而后采用MEGA(Version 4.0)软件包中的Kimura two-parameter矩阵模型和Neighbor-joining法进行进化树的构建，与高粱、玉米、水稻、短柄草、大麦的相似性分别为97%、94%、89%、89%和88%(图7)。

采用NCBI Blast分析程序对推导的氨基酸序列进行保守区域分析表明，甘蔗STK氨基酸系列拥有完整的STK基因家族保守区PKc域(图8)。

3 讨论

本研究通过RACE技术获得长为1133 bp的丝氨酸/苏氨酸激酶基因片段，其中5'UTR为54 bp，3'UTR为254 bp，包含完整的ORF(825 bp)，共编码274个氨基酸，其编码的氨基酸具有明显的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域。Hanks et al[7]认为蛋白激酶含有11个子域，第Ⅵ子域赋予了丝氨酸/苏氨酸激酶特异性[7-9]，因此，可以根据第Ⅵ子域保守基序DLKXXN[7]确定丝氨酸/苏氨酸序列。

多数情况下，我们仅了解植物信号转导通路中的一个组分，并不了解整个通路的各个组分。因此若要研究STK的信号通路，就需要探测其上下游各组分，以分别鉴定各自的调控子和靶蛋白。后续工作可通过酵母双杂交和生化分析来研究STK的生理生化功能[10，11]。

为进一步研究STK基因各种转录产物的生物学功能，本研究拟构建甘蔗STK基因的植物表达载体转入模式植物拟南芥，并进行相关研究。初步研究探讨STK在信号转导中的作用，尤其是STK在蔗糖代谢中的作用。

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