31例B型血友病患者凝血因子Ⅸ基因突变研究

刘丹娟，李莉艳，李 强，孙 竞，钟 梅，罗深秋△

（南方医科大学：1.细胞生物学教研室／骨与软骨再生重点实验室；2.南方医院妇产科；3.南方医院检验科；4.南方医院血液科，广州 510515）

血友病是一组X连锁隐性遗传的出血性疾病，临床上常见的有A型血友病（HA）和B型血友病（HB）两型，分别是由于凝血因子（F）Ⅷ和FⅨ基因突变所引起。在男性血友病患者中，HA占80%～85%，而HB仅占15%～20%，在男性中的发病率大约为1／30 000［1］，女性患者罕见。HB基因突变具有明显的异质性，可发生在FⅨ基因外显子、内含子、启动子及其侧翼序列的任何位置［2］。目前已知的FⅨ基因突变类型包括点突变、缺失、插入等。

本研究利用PCR法及DNA测序技术对31例HB患者进行FⅨ基因突变检测，对于明确FⅨ基因突变机制有重要意义，且丰富了FⅨ基因突变谱。

1 资料与方法

1.1 一般资料 31例HB患者均来自本院血液科及妇产科门诊，FⅨ活性测定均小于5%。

1.2 研究方法 采集HB患者外周血2mL，以乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，采用外周血DNA提取试剂盒（美国Life公司）提取DNA。根据FⅨ基因序列（Gene Bank K02402），参照文献［3］设计并合成8对扩增引物（表1），引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

PCR反应总体积为50μL，加入上游和下游引物各5pmol（终浓度为0.1μmol／L），4种dNTP各5nmol（终浓度为0.1 mmol／L），5μL 10×Taq PCR Buffer（100mmol／L Tris－HCl，15mmol／L MgCl2和 500mmol／L KCl，pH 8.3），2U Taq DNA聚合酶（TAKARA公司），基因组DNA 50～200ng。PCR反应在美国PE公司的9700型热循环仪上进行。测序工作由上海英骏生物技术有限公司完成。

表1 引物序列

续表1 引物序列

2 结 果

31例HB患者通过DNA测序均检测到了突变位点。检测结果显示，FⅨ基因的突变位点分散无热点区，突变类型也不同。本研究中共发现了34种突变，其中1例为三重突变，6例为双重突变，此外还发现13种新突变。31例HB患者均发现基因突变，其基因突变发生的碱基改变、具体部位（基因碱基序列编号采用Yoshitake方法［4］）、引起的氨基酸变化和是否为CpG突变热点见表2。

表2 31例HB患者FⅨ基因突变

续表2 31例HB患者FⅨ基因突变

3 讨 论

FⅨ基因定位于Xq27.1，基因全长约33.5kb，由8个外显子、7个内含子及其侧翼序列中的调控区所组成［5］，mRNA全长2 804bp。FⅨ基因任意位置的缺陷引起蛋白结构功能和数量的改变，均可导致HB的发生。

HB基因突变类型种类繁多，以点突变、短片段的缺失（少于30bp）和插入突变多见，其中80%左右为单个碱基的突变［6］。不同于 HA，HB的散发率可达30%～50%［7］。1990年Brownlee首次建立了HB突变数据库。随着病例数目的积累，新的缺陷正不断地被发现。从已报道的突变分布看，包括polyA信号在内的FⅨ基因所有区域均有突变发生。本研究除外6例缺失（一例全基因缺失和5例短片段缺失），其余均为点突变，占80.6%。由于编码与Ca2＋结合的EGF区及催化区，外显子4和8的突变发生率较高［8］。本研究中的31例患者，有11例发生于外显子4和8，占35.5%。而外显子1、6、7中突变较少，共占19.4%。

CpG双核苷酸区域被认为是突变热点［9－10］，刘敬忠等［11］采用PCR法和GAWTS技术也进一步证实了CpG确系突变热点，主要是（C→T／A）。研究中有7例发生在CpG热点上，类型为（C→T），（G→A）和（G→T），占22.6%。

Toyozumi等［12］确定了内含子1的第192核苷酸（FⅨ192）为二核苷酸多态性位点，存在于健康日本人中。王宁遂等［13］发现并计算出中国人FⅨ－192A和G的基因频率分别为0.81和0.19。本研究中有4例患者的突变发生于此处，进一步验证了该基因此位置的多态性。2例患者只检测出此惟一多态性位点需进一步检测未测序列，以确定致病突变位点。

经过最新的血友病B数据库资料查询，本研究共发现13种新突变，为国际上首次报道。其中4种为发生在外显子的错义突变，氨基酸改变分别为L－Q、Y－D、S－P和 V－G。除了－T为已报道的导致阅读框架移位的突变点外，其余3种均为新发现的缺失突变类型，其中－GCTGAAACCA和－GCTAAACA引起阅读框架移位，根据剪切位点的位置判断［14］，－ATTT为剪接位 点 缺 失。此 外，T6320A、C6828T、G6640A、A29753G、G30321T和T17517G等6种突变发生于内含子部位，已知6320为剪切位点，可确定T6320A为致病突变，其余5种突变是否为一种新的多态性或者为致病突变，则需要进一步研究。

本文报道了31例HB患者FⅨ基因突变的研究，对临床进行HB携带者筛查及产前基因诊断具有重要的参考和指导意义。而FⅨ基因新突变的发现，在丰富HB基因突变谱的同时，还有助于进一步了解FⅨ基因中某些氨基酸残基对于FⅨ凝血活性的重要性，为明确HB的分子致病机制提供了实验数据。

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