丹参酮IIA对异丙肾上腺素致心肌缺血损伤大鼠apelin及其受体的影响

陈 曦，赵永芳（解放军总医院国际医学中心住院三区，北京 100853）

Apelin是一种新近发现的心血管活性多肽，1998年由日本学者利用反向药理学的方法从牛胃的分泌物中提取并纯化出的孤儿受体APJ (apelin- angiotensin receptor-like, APJ) 的内源性配体[1]。Apelin 具有抗心肌损伤、降血压等方面的作用[2]。Apelin及其受体APJ在心血管组织中表达很高，可以调节心脏功能，对心脏有保护作用。丹参具有抗缺氧、抗炎、清除自由基等作用，对心肌缺血具有明显的保护作用[3]。丹参酮IIA作为丹参的主要脂溶性成分，对这种心血管活性多肽apelin及其受体是否有影响，目前相关文献报道甚少。本实验采用异丙肾上腺素(isoproterenol,ISO)诱导大鼠急性心肌缺血损伤模型，观察丹参酮IIA对大鼠血浆和心肌组织apelin和受体APJ的含量和表达的影响以及NO的变化，初步探索其抗心肌缺血损伤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂

雄性SD大鼠（200 ～ 240 g）由维通利华提供。异丙肾上腺素（Sigma公司）；丹参酮IIA（上海第一生化药业有限公司）；Trizol（GIBICO公司）；dNTP（Clontech公司）；MMuLV 逆转录酶、Taq DNA 聚合酶、RNasin、Oligo (dT) 15 Primer（Promega 公司）。抗APJ的抗体（abcam公司）；抗eNOS 和ser1177-eNOS（CST公司）。其他试剂均为市售分析纯。

1.2 大鼠心肌损伤模型的建立及分组

大鼠随机分为5组：正常对照组，ISO组，丹参酮IIA低、中、高剂量治疗组（0.75、1.50、3.0 g·kg-1）。治疗组每天灌胃1次，连续4周。ISO组及丹参酮IIA治疗组，第4周始皮下注射ISO，以每天20、10、5 mg·kg-1的递减剂量注射3 d，再以3 mg·kg-1的剂量注射2 d，建立大鼠心肌缺血损伤模型[4]。正常对照组则注射等量0.9%氯化钠注射液。

1.3 样本的采集

末次注射ISO后12 h，戊巴比妥钠30 mg·kg-1（ip）麻醉大鼠，颈动脉取血分别收集血浆和血清，- 20 ℃冻存。迅速处死大鼠，取出心脏，取少许心尖组织戊二醛固定，心肌组织透射电镜分析。另取心室组织1份与PBS混合，制备10%组织匀浆，离心取上清液。另取6只主动脉，- 80 ℃冻存，部分做Western blot检测APJ、eNOS和磷酸化eNOS的蛋白表达含量，部分做PCR检测apelin和APJ mRNA水平。

1.4 apelin、NO含量测定

采用酶联免疫吸附法测定血浆和心肌组织apelin含量；采用硝酸还原法，按试剂盒测定说明书方法测定血清和心肌组织中NO的含量。

1.5 心肌组织apelin及其受体APJ mRNA水平测定

按Trizol说明书提取各组大鼠心肌的总RNA，紫外分光光度计算定量。取2 μg RNA用MMuLV逆转录酶及OligodT逆转录成单链cDNA，再进行PCR扩增。根据荧光PCR曲线形态、CT值（阈值循环数）、扩增效率来判断反应体系的优劣，最终确定实时荧光定量PCR的反应条件：95 ℃ 10 s，95 ℃ 10 s，65 ℃ 40 s，40个循环。25 μL的反应体系：PreMix 12.5 μL，引物上下游各300 nmol，探针200 nmol，水7.5 μL，模板3 μL。以GAPDH mRNA标准化。

1.6 Western blot 法检测APJ、eNOS和磷酸化eNOS的蛋白表达

按常规方法提取蛋白样品及进行蛋白定量。取蛋白样品50 μg上样，12% SDS-PAGE电泳分离蛋白，用半干式电转移法将蛋白质转移到PVDF膜上。用含3%脱脂奶粉的封闭液封闭1 h后，加入1∶1000稀释的APJ、eNOS和ser1177-eNOS一抗，4 ℃孵育过夜，TBST 冲洗3次，加入按1∶5000稀释的二抗，室温孵育1 h，用TBST冲洗3次，ECL显色并曝光于X胶片，用凝胶图像分析系统进行扫描分析和拍照。

1.7 统计学分析

实验数据以（均数±标准差）表示，用one-way ANOVA 作统计学处理，组间比较用Student-Newman-Keuls （SNK）方法检验，P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 丹参酮IIA对心肌缺血损伤大鼠血浆和心肌组织apelin含量的影响

ISO致心肌缺血后，ISO组大鼠血浆和心肌组织apelin含量明显低于正常对照组54.2%和76.1%（P＜ 0.01）。与ISO组比较，中、高剂量丹参酮IIA治疗组血浆和心肌组织apelin有明显升高，血浆apelin分别增加了2.88倍和11.08倍（P＜ 0.01），心肌组织apelin分别增加99.4%和2.52倍（P＜ 0.01）。见图1。

图1 丹参酮IIA对心肌缺血损伤大鼠血浆和心肌组织apelin含量的影响

2.2 丹参酮IIA对心肌缺血损伤大鼠血浆和心肌组织NO含量的影响

与正常对照组相比，ISO组大鼠血浆和心肌组织NO含量明显减少25.6%和74.8%（P＜ 0.01）。给予丹参酮IIA药物后，高、中剂量治疗组血浆和心肌组织NO含量显著高于ISO组，血浆NO含量分别增加59.5%和1.08倍（P＜ 0.01），心肌组织中NO含量分别增加3.47倍和5.68倍（P＜ 0.01），见图2。

图 2 丹参酮IIA对心肌缺血损伤大鼠血浆和心肌组织NO含量的影响

2.3 丹参酮IIA对心肌缺血损伤大鼠组织apelin及其受体APJ mRNA表达的影响

Real-time PCR结果显示，与正常对照组比较，ISO组大鼠心肌apelin和APJ mRNA的表达水平分别下降77.1%和65.1%（P＜ 0.01）；与ISO组比较，丹参酮IIA 3.0 g·kg-1治疗组心肌apelin mRNA的水平明显升高3.04倍（P＜ 0.01），中、高剂量丹参酮IIA治疗组心肌APJ mRNA的水平明显升高，分别增高了1.01倍和2.46倍（P＜ 0.01），见图3。

图3 丹参酮IIA对心肌缺血损伤大鼠组织apelin及其受体APJ mRNA表达的影响

2.4 丹参酮IIA对心肌缺血损伤大鼠心肌组织中APJ、eNOS和磷酸化eNOS的蛋白表达的影响

Western blot结果显示，心肌缺血损伤大鼠心肌组织中APJ蛋白表达水平明显低于正常组，并且ser1177-eNOS 水平也有所降低（P＜ 0.01），中、高浓度的丹参酮IIA能逆转钙化心肌缺血损伤大鼠心肌组织中的APJ 蛋白表达水平和ser1177-eNOS 水平，结果见图4。

图4 丹参酮IIA对心肌缺血损伤大鼠组织APJ、eNOS和ser1177-eNOS的蛋白表达的影响

3 讨论

本实验中，大鼠心肌缺血损伤时，血液和心肌组织中apelin含量明显降低；心肌组织apelin和APJ mRNA水平显著下降。有类似研究表明：大剂量异丙肾上腺素所致的心肌缺血损伤大鼠的血浆和心室肌、房前肌中apelin含量显著降低，心肌中apelin和APJ mRNA表达降低；给予apelin可明显改善心肌损伤的程度[4]。

本实验结果显示，丹参酮IIA在明显减轻ISO所致的大鼠心肌缺血损伤的同时，血浆和组织apelin含量较ISO组显著升高，提示丹参酮IIA可能通过影响apelin水平改善缺血心肌血管舒缩功能等作用来抗缺血性心肌损伤。此外，高剂量丹参酮IIA治疗组大鼠心肌组织中的apelin含量较ISO组明显升高，该结果与其mRNA表达增加的结果一致；但是，丹参酮IIA治疗组大鼠血浆中apelin含量较心肌组织中升高更明显，提示除心肌组织外，丹参酮IIA可能还通过其他组织产生apelin，使其血中含量显著增加。另外，中、高剂量的丹参酮IIA治疗组大鼠心肌组织中APJ mRNA水平较ISO组有显著增高。提示丹参酮IIA可能通过上调大鼠心肌组织中apelin/APJ系统发挥抗ISO造成的心肌损伤。

Apelin在体内可增加NO的生成。Tatemoto等[5]给麻醉大鼠腹腔内注射apelin，结果提示apelin可能通过eNOS促进NO生成进而降低血压。Jia等[6]用apelin刺激离体大鼠主动脉，结果大鼠血管NO生成和总NOS活性呈浓度依赖性增加，且以内皮型NOS（eNOS）活性升高为主，进一步证实apelin通过NO途径扩血管、降血压。在心血管系统，NO除介导内皮依赖的舒张血管作用外，具有直接淬灭氧自由基，抑制细胞膜脂质过氧化，从而保护心肌细胞等作用[7-8]。本实验也发现，丹参酮IIA具有显著的抗心肌缺血损伤作用，同时血清和心肌组织中NO水平明显增加，且血液中NO含量甚至高于正常对照组，而且该结果也与血液中apelin含量的显著升高结果一致。Jia等[6]研究发现，apelin可浓度依赖性增加大鼠主动脉NO的生成及NOS活性，可浓度依赖性增强动脉组织L-Arg的转运。

本实验结果发现，丹参酮IIA可以使eNOS的磷酸化水平增高，使eNOS的活性增强，NO生成增多。提示apelin通过增加外L-Arg转运及NOS活性，增加NO的生成，从而引起血管扩张，发挥降血压的作用。由此，我们推测，丹参酮IIA抗心肌缺血损伤的机制可能与其显著增加apelin/APJ表达、增加eNOS的磷酸化和活化水平，进而升高心肌组织和血浆中NO浓度等作用有关。本实验中发现丹参酮IIA减轻了ISO造成心肌损伤的发生发展，为心肌损伤相关的心血管疾病提供新的靶点，值得深入探讨。

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[5] Tatemoto K, Takayama K, Zou MX,et al. The novel peptide apelin lowers blood pressure via a nitric oxide-dependent mechanism[J]. Regul Pept, 2001, 99(2-3): 87-92.

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