肝癌石蜡包埋组织miRNA提取方法的优化＊

党裔武，容敏华，陈 罡△

（1.广西医科大学第一附属医院病理科，南宁530021；2.广西医科大学附属肿瘤医院实验研究部，南宁530021）

肝癌石蜡包埋组织miRNA提取方法的优化＊

党裔武1，容敏华2，陈 罡1△

（1.广西医科大学第一附属医院病理科，南宁530021；2.广西医科大学附属肿瘤医院实验研究部，南宁530021）

目的改进并优化从肝癌（HCC）甲醛固定石蜡包埋组织（FFPE）提取并检测微小RNA（miRNA）的方法。方法使用miRNeasy FFPE试剂盒探讨提取HCC石蜡组织miRNA最佳切片厚度及蛋白酶K作用时间。实时定量RT－PCR检测miR－221、miR－146a、let7－a、miR－191、miR－103及RNU6B的表达量。将 HCC细胞制成石蜡组织，对比同一细胞系新鲜细胞及石蜡包埋细胞的各个miRNA表达量差异。结果切片厚度30μm，蛋白酶K作用时间48h时提取miRNA效果最佳。各HCC细胞系及临床 HCC石蜡组织均有不同水平的 miRNA－221、miR－146a、let7－a、miR－191、miR－103及 RNU6B表达。同一细胞系新鲜细胞与石蜡包埋后的各miRNA表达无明显差别。结论改良后的miRNeasy FFPE提取方法能提取石蜡组织中的miRNA，可重复性强，可推广用于临床各种石蜡包埋组织的miRNA提取。

微RNAs；甲醛；石蜡包埋；肝肿瘤；逆转录聚合酶链反应

微小RNA（microRNA，miRNA）是一组微小的内源性非编码单链小分子RNAs（21－25nt），由具有发夹结构的约70～90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后而生成。miRNA现已被证实在不同的生理过程，诸如发育、分化、增殖、凋亡及病毒感染中发挥着重要的作用［1－5］。最新研究表明，有部分miRNA与肝癌（hepatocellalar car einoma，HCC）等肿瘤的关系密切。一些HCC组织特异性的miRNA亦被证实在HCC的发生过程中起到了非常重要的调节作用［6－10］。临床甲醛固定石蜡包埋（formalin－fixed paraffin－embedded，FFPE）标本是进行医学回顾性研究的最佳资源。虽然新鲜临床标本经过固定、脱水、浸蜡、包埋等步骤后，mRNA部分已降解或修饰，但从FFPE提取总mRNA进行医学研究仍得到了长足的进展［11－12］。miRNA因为本身体积微小，故在FFPE组织中保存相当稳定，与新鲜组织样品中miRNA相差无几，因此使用FFPE组织进行相关miRNAs的研究已成为当前的热点。本实验使用miRNeasy FFPE试剂盒探讨提取肝癌石蜡组织miRNA最优化的条件，并对比使用该方法提取的石蜡标本miRNA表达与相应的新鲜细胞的miRNA表达的差异，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 人 HCC细胞系 HepG2，HepB3，SNU449及SNU398均购自美国ATCC公司，分别用DMEM与RPMI 1640培养液（均购自美国Gibcol公司）培养。取对数生长期细胞（约1×107），以1 000r／min离心5min，去上清液；D－Hanks平衡盐溶液（pH 7.2）清洗2遍；最后一次吸出上清液后，沿离心管管壁慢慢地加入1滴蛋清甘油（蛋清∶甘油＝1∶1），用滴管轻轻地把细胞与蛋清甘油混匀，将细胞用10%中性缓冲甲醛固定12h，低速离心（200r／min）5min；离心后的细胞团用擦镜纸包裹，然后进行各级乙醇脱水（各30min）、二甲苯透明（2×30min）、浸蜡（3×30min）及石蜡包埋［18］。石蜡组织标本40例，为广西医科大学第一附属医院病理科确诊的HCC患者，均含有距癌结节2cm以上之癌旁组织。

1.2 FFPE组织含miRNA总RNA的提取 miRNeasy FFPE Kit购自比利时Qiagen分公司。按试剂说明书操作并进行相关步骤不同参数的测试，简述如下:（1）蜡块分别切片5、10、20、30、40μm厚，根据组织大小将2～16张切片置于无RNA酶的EP管中，加二甲苯1mL，剧烈振荡10s，20℃下14 000 r／min离心2min，弃上清液。视石蜡多少重复上述步骤1～3次；（2）加1mL无水乙醇，振荡混匀，14 000r／min离心2min，弃上清液；（3）风干后加240μL PKD缓冲液及10μL蛋白酶K，振荡混匀，视组织溶解情况55℃分别孵育15min、1、12、24、36、48h。如组织不溶解，则于24h时再加10μL蛋白酶K，继续孵育12～24h，然后80℃15min；（4）加500μL RBC缓冲液，振荡混匀，将液体全部转移至gDNA Eliminator离心管，10 000r／min离心30s，弃离心管，保留离心后液体；（5）加入无水乙醇1.2mL，混匀，将700μL移至miRNeasy Min E－lute离心管，10 000r／min离心15s，弃离心液，重复上述过程至全部样本离心完毕；（6）加500μL RPE缓冲液，10 000r／min离心15s，弃离心液，重复上述步骤，但第2次离心2min；（7）将miRNeasy Min Elute离心管置入新的收集管，14 000r／min离心5min，弃离心液；（8）将miRNeasy Min Elute离心管置入最后的RNA收集管，加30μL无RNase 14 000r／min离心1min溶解总RNA（含 miRNA），使用ND－1000Nano Drop检测RNA质量及浓度。

1.3 实时定量RT－PCR技术检测miRNA表达 miRNA检测引物、探针（miR－221、miR－146a、let7－a、miR－191、miR－103和RNU6B）、逆转录试剂盒及实时定量RT－PCR试剂盒购自Applied Biosystems公司。细胞总RNA（含miRNA）使用 miRNeasy Mini Kit（比利时Qiagen分公司）抽提。取各组总RNA各200ng，加入到含特异引物的15μL的RT反应体系中行miRNA逆转录反应。取2μL cDNA样本使用 ABI－Prism 7900HT PCR仪（Applied Biosystems）行实时定量PCR检测。所有实验重复3次。

1.4 统计学处理 采用SPSS19.0软件进行分析，计量资料以±s表示，两两比较采用LSD法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 总RNA纯度 所有标本不同条件下抽提的总RNA（含miRNA）OD260／OD280值均在1.80～2.06之间，OD260／OD230值均在1.89～2.08之间。

2.2 切片厚度与 miRNA表达的关系 HepG2、HepB3、SNU449及SNU398细胞均制成蜡块，并选取3例HCC病例及其对应癌旁正常肝组织进行不同厚度与miRNA表达量关系的测试。10个蜡块不同切片厚度均能检测出相关miRNA的表达。但5μm厚的切片Cq值明显高于其他厚度切片，miRNA表达量下降。同一miRNA表达量最高者均为厚30 μm的切片，Cq值低于5μm者1～2循环不等。30μm组与其他组别相比差异有统计学意义（P＜0.05）。从5、10μm至20、30μm，各个miRNA的表达量呈现上升趋势，但40μm厚之切片miRNA表达略低于30μm者。HepG2及其中1例HCC和癌旁肝组织各miRNA表达，见图1。

2.3 蛋白酶K作用时间与miRNA表达的关系 试剂盒说明书建议蛋白酶K 55℃孵育15min，但孵育15min后肉眼仍可见明显的组织块，将孵育时间增加至1h，组织块仍未消失。故将孵育时间延长至12～24h，直至液体呈现清亮。如一次抽提的组织较多，在24h时补加一次蛋白酶K，继续孵育12～24 h。为观察蛋白酶K作用时间对miRNA表达的影响，选取1例HCC蜡块（表面积200mm2），每次切片2张，厚30μm，该例首次加蛋白酶K 24h后，液体仍浑浊，则在24h时再加第2次蛋白酶K，36h时液体清亮。不同蛋白酶K作用时间下总RNA（含 miRNA）质量分别为，1h:1 365.87ng／μL；12h:1 855.56ng／μL；24h:2 045.65ng／μL；36h:2 746.87ng／μL；48h:2 718.56ng／μL。以上5组总 RNA 均能检测出相关miRNA的表达。但1、12及24h之Cq值明显高于36h及48h，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。

图1 FFPE组织不同厚度切片与miRNA表达的关系

图2 HCC蛋白酶K作用时间与miRNA表达的关系

2.4 组织量与miRNA表达的关系 如一次提取的组织量过多，有可能导致各个步骤的离心管阻塞，从而影响提取质量和数量。本实验也选取3例HCC组织，进行不同组织量（3.0、6.0、12.0、24.0mm3）的对比（图3），结果显示组织总体积为24.0mm3时，RNA量最高，并未发生离心管阻塞现象。其中病例1不同组织体积提取总RNA数量分别为900.24、1 800.45、2 799.34、4 935.45ng／μL，病 例 2 为 687.45、1 356.45、2 436.34、4 535.45ng／μL，病 例 3 为 865.42、1 564.72、2 987.12、5 432.56ng／μL。各组RNA也经实时荧光定量RT－PCR检测，各miRNA表达量未见明显差别。

图3 蛋白酶K作用时间与miRNA表达的关系

2.5 新鲜细胞及石蜡组织miRNA表达的对比 抽提HepG2、HepB3、SNU449及SNU398 4种肝癌细胞系新鲜细胞及石蜡组织的总RNA，实时荧光定量RT－PCR检测各miRNA表达量差异无统计学意义（P＞0.05），HepB3、SNU449及SNU398结果未示，见图4。

图4 HepG2同一细胞系新鲜细胞及石蜡组织miRNA表达的对比

3 讨 论

石蜡组织中RNA降解或修饰严重，但是miRNA因为本身体积较小，大部分石蜡组织中的miRNA未被修饰，保存完整，为利用石蜡组织资源研究miRNA的在各种疾病中的作用机制提供了基础［12］。miRNeasy FFPE试剂盒能提取纯化长度18个核苷酸以上的总RNA，独特的裂解和孵育条件逆转甲醛对RNA造成的修饰。并且裂解缓冲液可将RNA从组织切片中有效释放出来，同时避免进一步的RNA降解。该试剂盒使用gDNA去除柱有效去除基因组DNA污染。但在组织脱蜡的过程中，如果缺少完整细胞膜的保护，二甲苯或无水乙醇可溶解部分miRNA，造成miRNA的丢失。成人肝细胞直径为20～30μm，故过薄的切片细胞膜的完整性受到破坏，直接影响miRNA提取的数量与质量。本实验将试剂盒推荐的5～10μm切片厚度增加至20、30、40μm，结果发现30μm厚度保持完整的miRNA效果最佳。

蛋白酶K是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶。它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，用于生物样品中蛋白质的一般降解。在RNA提取中，蛋白酶K的作用还有降解RNA酶，防止RNA的降解。本研究发现，蛋白酶K作用时间对miRNA数量及质量有着重要的影响，最佳作用时间应为肉眼观标本液体呈现清亮后再延长12h。在蛋白酶K作用期间，可多次剧烈振荡，协助样品中蛋白质的降解。

综上所述，经改良后的miRNA抽提方法稳定，可重复性强，提取的含miRNA的总RNA纯度高，产量高，多个miRNA表达量与从新鲜细胞提取的miRNA对比差异无统计学意义（P＞0.05）。同时保存15年以上的FFPE组织也可以提取出高质量的含miRNA的总RNA。故经过条件优化的从FFPE组织提取miRNA的方法值得推广使用。

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Optimization of MicroRNA extraction method from HCC FFPE tissues＊

Dang Yiwu1，Rong Minhua2，Chen Gang1△
（1.Department of Pathology，the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning，Guangxi 530021，China；2.Department of Research，Affiliated Cancer Hospital，Guangxi Medical University，Nanning Guangxi 530021，China）

ObjectiveTo modify and optimize the microRNA（miRNA）extraction and detection approach from hepatocellular carcinoma（HCC）formalin fixed paraffin embedded（FFPE）tissues.MethodsmiRNeasy FFPE kit was performed to investigate the optimizational thickness of sections from HCC FFPE tissues and time of protease K treatment.Afterwards，expression of miR－221，miR－146a，let7－a，miR－191，miR－103and RNU6Bwas detected by real time RT－PCR.The difference of the miRNA expression between fresh cells and FFPE tissues from the same cell line was also compared by real time RT－PCR.Results30μm thickness and 48hof proteinase K treatment were the best parameters to isolate miRNA.Different expression levels of all the miRNAs could be detected in both the HCC cells samples and clinic FFPE samples.There was no significant variation of the miRNA expression between fresh cells and FFPE samples from the same cell lines.ConclusionThe optimizational miRNeasy FFPE method is applicable for miRNA extraction from FFPE tissues.The method is productive and can be popularized for the miRNA isolation for different FFPE tissues.

microRNAs；formaldehyde；paraffin embedding；liver neoplasms；reverse transcriptase polymerase chain reaction

10.3969／j.issn.1671－8348.2012.34.020

A

1671－8348（2012）34－3623－03

广西自然科学基金资助项目（2010GXNSFB013059）。 △

，Tel:（0771）5356534；E－mail:chen＿gang＿triones＠163.com。

2012－06－13

2012－09－12）

·调查报告·