禽流感病毒RT－LAMP检测技术的建立

彭 宜，谢芝勋，刘加波，庞耀珊，邓显文，谢志勤，谢丽基，范 晴，罗思思

（广西兽医研究所广西畜禽疫苗新技术重点实验室，广西南宁530001）

禽流感（Avian influenza，AI）是由禽流感病毒（AIV）引起的禽流行性感冒的简称［1］。根据AIV表面糖蛋白血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）抗原性不同，AIV可分为16个HA亚型和10个NA亚型［2－3］。禽流感据其临床症状又可分为高致病性禽流感（Highly pathogenic avian influenza，HPAI）和低致病性禽流感（Mildly pathogenic avian influenza，MPAI）。HPAI由H5、H7亚型AIV引起，以高发病率和高病死率为特征。MPAI可由所有的HA亚型（H1－H16）AIV引起，通常引起较温和的临床症状［4－5］。随着 H5、H7亚型 HPAI的暴发，MPAI没有引起人们足够的重视，直到1999年香港H9N2亚型禽流感病毒感染人的事件才引起世界对MPAI的关注。有关研究还表明1997年香港人源H5N1亚型 AIV 与 A／Teal／HK／W 312／97（H6N1）有7个基因片段高度同源［6－7］。越来越多的研究表明家禽中的低致病性禽流感病毒（MPAIV）可以通过基因重排为感染人类的流感病毒提供基因或直接突破种间屏障感染人［8－12］。禽流感不仅给养殖业带来巨大经济损失，而且严重威胁人类健康，因此有必要利用快速简便特异的检测技术加强AIV的病原学监测工作。

环介导等温扩增技术（loop－mediated isothermal amplification，LAMP）是近年来发展起来的在等温条件下进行的新型核酸扩增反应，该技术具有灵敏、特异、结果便于观察等优点而被广泛应用于各种病原微生物的检测［13－19］。本研究设计了针对AIV M基因的特异性LAMP引物，并优化相关反应条件，建立的 AIV 逆转录－环介导等温扩增 （RTLAMP）检测技术灵敏、特异，并实现了反应结束即可用肉眼直接对结果进行可视化判定，整个反应操作简便、快速、成本低廉，尤其适合在基层进行AI的早期诊断和大规模筛查。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 H1、H3、H4、H6、H9、H11亚型 AIV由广西兽医研究所生物技术研究室分离鉴定，其他亚型禽流感病毒RNA为美国康州大学 Mazhar I Khan教授惠赠；新城疫病毒（NDV）F48、传染性支气管炎病毒（IBV）M41、传染性喉气管炎病毒（ILTV）北京株及鸡毒支原体（MG）S6由广西兽医研究所生物技术研究室保存提供。

1.1.2 主要试剂 Bst DNA聚合酶（大片段）、Mg－SO4、Betaine为 New England Biolabs公司产品；MMLV逆转录酶、d NTP为MBI公司产品；荧光染料为International Laboratory公司产品；SPF鸡胚购自北京梅里亚公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA 及 DNA 的抽提根据 Axy PrepTMBody Fluid Viral DNA／RNA Miniprep Kit（爱思进公司）说明书制备样品DNA／RNA，置－70℃保存备用。

1.2.2 引物的设计与合成 利用Lasergene软件对大量不同HA亚型AIV的M基因序列进行比对，运用在线软件Primer Explorer V4在M基因的保守区设计3套LAMP引物。每套LAMP引物包括1对外引物、1对内引物和1对环引物，其中F3和B3为外引物，FIP（F1c＋F2）和BIP（B1c＋B2）为内引物，LF和LB为环引物。引物由广州Invitrogen公司合成。通过3次以上重复试验，确定特异性和敏感性最好的一套引物（表1）。

表1 RT－LAMP引物序列Table1 Sequences of RT－LAMP primers

1.2.3 RT－LAMP反应体系的优化 将影响RTLAMP扩增效率的反应成分包括MgSO4、Betaine、Bst DNA Po Lymerase、d NTP和反应条件（时间、温度）在如下浓度和条件范围内进行优化：MgSO4（0.6、1、2、3、4、5、6、7、8、9 mmol／L），Betaine（0.2、0.5、0.8、1、1.2、1.5、1.9 mmol／L），Bst DNA Po L－ymerase（4 、5 、6 、7 、8、9 、10 、12、14U），d NTP（0.6、0.8、1、1.2、1.4、1.6 mmol／L）。将温度按59、60、61、62、63、64℃依次递增，反应时间为30、45、60 min。多次重复试验后确定最佳反应条件和反应试剂的最佳浓度。

1.2.4 灵敏度试验 使用 Beckman DU－800紫外分光光度计测定总RNA含量，制备含量分别为1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg、1 fg的禽流感病毒总RNA模板，对各含量禽流感病毒总RNA用RT－LAMP方法和一步RT－PCR方法同时进行扩增，RT－PCR扩增引物为F3和B3，RT－LAMP反应产物直接可视化观察，RT－PCR扩增产物10 g／L琼脂糖凝胶电泳观察结果。

1.2.5 特异性试验 以不同亚型AIV及NDV、IBV、ILTV、MG核酸为待检样品利用优化好的RT－LAMP反应体系进行检测，对RT－LAMP方法的特异性进行检验。

1.2.6 RT－LAMP反应结果的观察 RT－LAMP反应之前将荧光试剂（Calcein和MnCl2的混合液）加入反应体系中，反应结束后可在可见光或紫外线下根据反应液的颜色变化用肉眼对结果直接进行判定。也可取5μL产物经15 g／L琼脂糖凝胶电泳观察结果。

1.2.7 临床样品的检测 应用建立的 AIV－RTLAMP方法对活禽市场家禽泄殖腔棉拭子样品及感染鸡、健康鸡脏器组织研磨混合液共计200份样品进行检测，所有样品同时用经典的鸡胚接种病毒分离方法、传统的RT－PCR方法进行检测，检验AIV－RT－LAMP方法的可靠性。

2 结果

2.1 RT－LAMP反应体系的优化和结果观察

RT－LAMP反应总体系为25μL，优化后的反应体系详见表2。在63℃水浴锅或金属恒温槽中，反应45 min，80℃作用5 min终止反应。反应产物经15 g／L琼脂糖凝胶电泳后，阳性产物可出现LAMP反应所特有的特征性条带（图1）。同时反应结束后，不需打开反应盖，即可直接可见阳性反应液颜色由反应前的浅桔色变为浅绿色、紫外光下可发绿色荧光（图2 A和图2 B）。

表2 RT－LAMP反应体系Table2 The reaction system of RT－LAMP assay

2.2 特异性试验结果

如表3所示，建立的RT－LAMP方法能特异性的检测所有亚型AIV，而对其他呼吸道病原体呈阴性反应。

2.3 灵敏度检验

如图2所示 RT－LAMP方法对禽流感病毒RNA的最小检测限为10 fg，灵敏度是RT－PCR的1 000倍。

2.4 临床样品检测

如表4所示，200份临床样品用RT－LAMP方法检测到23份AIV，结果与病毒分离结果相符，而常规RT－PCR方法漏检了2份棉拭子样品。

图1 RT－LAMP反应产物琼脂糖凝胶电泳检测结果Fig.1 Products of RT－LAMP assay confirmed by agarose gel electrophoresis

图2 RT－LAMP和RT－PCR检测AIV的灵敏度比较Fig.2 Comparative sensitivity tests between RT－LAMP and RT－PCR assays for detection of AIV

表3 RT－LAMP特异性检测结果Table3 Specificity results of RT－LAMP assay

表4 临床样品检测结果Table4 Detection results of clinic samples by virus isolation，RT－PCR，RT－LAMP

3 讨论

AIV为RNA病毒，由于RNA依赖的RNA聚合酶缺乏矫正功能，所以RNA病毒的突变率比DNA病毒高，在宿主防御机制选择压力下，AIV的表面抗原基因发生点突变而引起抗原漂移［20］，另外AIV有多种亚型，且基因组为分8个节段，当不同亚型AIV感染同一细胞时，病毒基因组可通过互换基因发生基因重排而引起抗原转变［21］。水禽是AIV的储存库，众多亚型AIV都能从水禽体内分离到，且同时感染不同亚型AIV的现象比较普遍，这就为基因重排创造了有利条件，易于产生引起人类流感大流行的新流行株，可见加强AIV监测的重要性。近年来时有发生AIV跨越宿主屏障直接感染人并引起人死亡的事件，提示禽流感不再只是养殖业的威胁，更严重威胁到人类的健康，发展快速、准确的AIV检测技术对禽流感及人禽流感防控尤为重要。

LAMP反应是通过一套识别靶序列上8个特异区域的引物和具有链置换活性和瀑布式核酸扩增功能的Bst DNA聚合酶，在等温条件下迅速进行的核酸扩增反应，整个反应不需要特殊的仪器设备，仅在水浴锅中30 min～60 min即可完成［22］。本研究通过比较基因库里大量AIV－M基因序列，设计了多套特异的LAMP引物，通过多次重复试验，筛选出一套特异性和敏感性最好的LAMP引物，并优化反应条件和体系，建立的RT－LAMP技术能特异的检测所有亚型AIV而对其他家禽呼吸道病原微生物呈阴性反应，灵敏度是常规RT－PCR方法的1 000倍，临床样品的检出率与经典的鸡胚病毒分离方法相符。本研究还在反应之前加入荧光试剂（Calcein和MnCl2的混合液），反应结束后可通过肉眼在可见光或紫外线下直接观察反应液的颜色变化来判定结果［23］，既避免了因反应结束后开盖加荧光染料时污染环境而造成假阳性结果的发生，同时又实现了反应结果的可视化观察。

本研究建立的AIV RT－LAMP可视化检测技术快速、简便、灵敏、特异且成本低廉，尤其适合在仪器设备简单、技术人员缺乏的基层用该技术进行禽流感的早期快速诊断和筛查。

［1］甘孟侯.禽流感［M］.北京：北京农业大学出版社，2002：74－78.

［2］Webster R G，Bean W J，Gorman O T，et al.Evolution and ecology of influenza A viruses［J］.Microbiol Rev，1992，56：152－179.

［3］Fouchier A M，Munster V，Wallensten A，et al.Characterization of a novel influenza A virus hemagglutinin subtype（H16）obtained from black－headed gulls［J］.J Virol，2005，79（5）：2814－2822.

［4］Alexander D J.A review of avian influenza in different bird species［J］.Vet Microbiol，2000，74（1－2）：3－13.

［5］Edwards S.OIE laboratory standards for avian influenza［J］.Dev Bio，2006，124：159－162.

［6］Shortridge K F，Zhou N N，Guan Y，et al.Characterization of avian H5N1 influenza viruses from poultry in Hong Kong［J］.Virology，1998，252：331－342.

［7］Peiris M，Yuen K Y，Leung C W，et al.Human infection with influenza H9N2［J］.Lancet，1999，354：916－917.

［8］Crosby A W.America’s forgotten pandemic：the influenza of 1918［M］.Cambridge University Press，Cambridge，United Kingdom，1989.

［9］Kawaoka Y，Krauss S，Webster R G.Avian－to－human transmission of the PB1 gene of influenza A viruses in the 1957 and 1968 pandemics［J］.J Virol，1989，63：4603－4608.

［10］Cockburn W C，Delon P J，Ferreira W.Origin and progress of the 1968－1969 Hong Kong influenza epidemic［R］.Bull W H O，1969，41：345－353.

［11］Dawood F S，Jain S，Finelli L，et al.Emergence of a novel swine－origin influenza a（H1N1）virus in humans［J］.N Engl J Med，2009，360（25）：2605－2616.

［12］Liu S，Ji K，Chen J，et al.Panorama phylogenetic diversity and distribution of type A influenza virus［J］.PLoS ONE，2009，4：e5022.

［13］Curtis K A，Rudolph D L，Owen S M.Rapid detection of HIV－1 by reverse－transcription loop－mediated isothermal amplification（RT－LAMP）［J］.J Viol Meth，2008，151（2）：264－270.

［14］Pham H M，Nakajima C，Ohashi K，et al.Loop－mediated isothermal amplification for rapid detection of Newcastle disease virus［J］.J Clin Microbiol，2005，43（4）：1646－1650.

［15］Xu J T，Zhang Z M，Yin Y B，et al.Development of reversetranscription loop－mediated isothermal amplification for the detection of infectious bursal disease virus［J］.J Virol Meth，2009，162：267－271.

［16］Poon L L M，Leung C S W，Chan K H，et al.Detection of human influenza a viruses by loop－mediated isothermal amplification［J］.J Clin Microbiol，2005，43（1）：427－430.

［17］Yamazaki W，Taquchi M，Ishibashi M，et al.Development of a loop－mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of campylobacter fetus［J］.Vet Microbiol，2009，136（3／4）：393－396.

［18］Hong T C，Mai Q L，Cuong D V.Development and evaluation of a novel loop－mediated isothermal amplification method for rapid detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus［J］.J Clin Microbiol，2004，42：1956－1961.

［19］Peng Y，Xie Z X，Liu J B，et al.Visual detection of H3 subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop－mediated isothermal amplification assay［J］.Virol J，2011，8：337.

［20］Hinshaw V S，Bean W J，Webster R G，et al.Genetic reassortment of influenza A viruses in the intestinal tract of ducks［J］.Virology，1980，102（2）：412－419.

［21］Webster R G，Laver W G，Air G M，et al.Molecular mechanisms of variation in influenza viruses［J］.Nature，1982，296（5853）：115－121.

［22］Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al.Loop－mediated isothermal amplification of DNA［J］.Nucleic Acids Res，2000，28（12）：e63.

［23］Tomita N，Mori Y，Kanda H，et al.Loop－mediated isothermal amplification（LAMP）of gene sequences and simple visual detection of products［J］.Nature Protocal，2008，3（5）：877－882.