牛支原体的分离鉴定及16SrRNA基因序列分析

伍晓红，储岳峰，张 轩，赵 萍，高鹏程，贺 英，逯忠新＊

（1.中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室 农业部草食动物疫病重点开放实验室，甘肃兰州730046；2.西藏昌都左贡县兽医站，西藏左贡854400）

牛支原体（Mycoplasma bovis）主要引起牛的肺炎、关节炎、乳房炎、角膜结膜炎等［1］。该病原于1961年首次在美国患有乳房炎的病牛中分离得到，之后在欧洲和北美流行并造成了严重的经济损失［2］。辛九庆等［3］首次在国内患肺炎犊牛的肺脏中分离到牛支原体，从而证实了国内部分地区也存在牛支原体肺炎的流行。冉智光等［4］又从患严重肺炎和关节炎的调入肉牛中分离出了牛支原体，进一步证实牛支原体感染已经对中国部分地区养牛业的发展造成了严重的影响。

有关研究报道，在健康牛呼吸道中几乎分离不到牛支原体，只有在感染牛的呼吸道中能够分离到，并经常引起临床发病［5］。近年来，在我国不同地区相继有犊牛肺炎病例发生，由于在临床症状和病理剖检变化方面与牛传染性胸膜肺炎非常相似，曾引起养牛业界的恐慌［6］。2011年，甘肃通渭某牛场出现严重的犊牛呼吸系统感染，主要表现为肺炎症状，病死率达10%。本研究对送检的犊牛肺脏病料进行了支原体分离和鉴定，并通过16 S RNA基因测序进行了分子鉴定，证实为牛支原体。

1 材料与方法

1.1 材料

采集甘肃通渭发病犊牛病变肺脏样品2份；用Thiaucourt＇s支原体培养基分离［7］。

1.2 方法

1.2.1 病原分离 无菌取约1 g肺组织，加2 mL液体培养基研磨匀浆，1 000 r／min离心5 min取上清，按1∶10倍比稀释接种至液体培养基中，每个稀释度接种2管，共接种3个稀释度，置37℃培养。每隔48 h进行一次传代或盲传。传至2代后取培养基颜色变黄且不浑浊者或轻微浑浊者，接种于固体培养基，置CO2培养箱中继续培养72 h～96 h，挑取单个克隆接种液体培养基，待生长后再接种固体培养基，至少3次克隆纯化后，用甘油将培养物保存于－70℃。

1.2.2 生化试验 参考文献［8］的方法进行生化试验。

1.2.3 PCR鉴定 使用北京天根生化科技有限公司的细菌基因组DNA抽提试剂盒提纯培养物基因组DNA。利用牛支原体特异性引物P1：5′－TTTTAGC － TCTTTTTGAACAAAT－3′， P2： 5′－GGCTCTCATT－AAGAATGTC－3′对分离物进行PCR 鉴定［9］。

1.2.4 16 SrRNA序列测定与分析 根据已发表文献［10］报道的方法扩增支原体培养物16 SrRNA基因序列，预计扩增片段长度为1.6 kb。将PCR扩增产物连接到T载体中送去南京金斯瑞生物技术有限公司进行测序，用Lasergene 7.01软件中的Meg Align程序将测序结果与部分支原体菌株的16 SrRNA序列进行比对分析。

2 结果

2.1 病原分离

在液体培养基中盲传2代后，2份样品的培养基颜色开始变黄，呈轻微混浊状。将培养物纯化，获得2份纯培养物，分别命名为GT－01和GT－02。GT－01和GT－02在固体培养基生长，72 h后可观察到针尖状大小的菌落，低倍普通光学显微镜下可看到菌落呈圆形，边缘整齐，具有典型的“油煎蛋状”形态（图1）。

图1 GT－01株的纯化菌落形态（40×）Fig.1 Colony of the isolate GT－01（40×）

2.2 生化试验

GT－01和GT－02培养物均对洋地黄皂甙敏感，具有磷酸酯酶活性，四氮唑还原试验阳性，但不能水解葡萄糖、甘露醇、精氨酸，不消化酪蛋白，与已报道牛支原体生化特性相符。

2.3 PCR鉴定

利用牛支原体特异性的P1和P2引物可以从GT－01和GT－02基因组总DNA中扩增出约1 911 bp的片段，与预期片段大小相符（图2）。

图2 牛支原体分离物PCR扩增结果Fig.2 PCR amplification of mycoplasma isolates

2.4 16 S rRNA基因序列分析

16 S rRNA基因序列分析表明，GT－01和GT－02序列同源性为99.9%；与GenBank中公布的其他5株不同的支原体16 S rRNA基因进行同源性分析，GT－01和GT－02与牛支原体标准株PG45同源性分别高达99.4%和99.6%。

图3 GT－01和GT－02分离株16 S rRNA基因序列的同源性分析Fig.3 Homology analysis of 16 S rRNA gene of the isolates GT－01 and GT－02

3 讨论

尽管牛支原体可引起多系统感染，但呼吸道感染是牛支原体主要的致病表型之一，牛支原体肺炎已成为当前世界上许多国家和地区牛的重要呼吸道传染病，对养牛业造成严重的经济损失。感染牛可通过呼吸道传播成为主要的传染源，其传播过程可持续几个月甚至几年。Laak E A等［11］研究发现，在荷兰育肥牛场中牛支原体感染率在20%以上。英国的某项调查显示，55个牛场中有半数牛场可检测到牛支原体特异性抗体［12］。在瑞士，牛支原体导致的呼吸道疾病占牛全部呼吸道疾病的50%，感染牛群生长速度下降8%［13］。2008年，我国湖北省新从外地引进肉牛发生了以坏死性肺炎为主要特征的呼吸道传染病，引起了很高的发病率和病死率，后确定该病为牛支原体引起的“传染性牛支原体肺炎”［10－14］，证实了该病在我国流行，此后又蔓延至重庆等全国等多个地区，给我国养牛业造成了较大危害。本研究首次从甘肃地区临床表现肺炎的犊牛肺组织中分离到牛支原体，证实该病已在甘肃省存在，给当地养牛业生产提出了新的挑战。

在牛支原体引起的呼吸系统感染临床诊断中，由于临床症状和病理剖检变化与牛传染性胸膜肺炎（牛肺疫）类似，需进行较为准确的实验室诊断。实验室诊断主要包括病原学和血清学诊断两个方面。目前国内还没有有效的血清学诊断方法，国外试剂盒价格昂贵，且需要采集感染不同时期的血清进行比对以辅助诊断。因此，病原分离和分子鉴定成为目前较为可行的确诊依据［3］。本试验使用的特异性PCR引物，对无乳支原体标准株PG2和牛肺疫支原体PG1株均无交叉扩增，与原文献报道的可用于鉴别牛支原体和无乳支原体结果一致［9］，因此具有较好的特异性，是一种快捷方便的分子诊断手段。

16 SrRNA基因序列分析表明，来自于同一牛场的GT－01和GT－02两个分离株同源性为99.9%，表明二者之间具有一定的差异，这是否意味着同一牛场可能同时流行不同的菌株，或者牛支原体在流行过程中能发生快速变异，尚需要进一步研究。与GenBank中的其它支原体种的序列比对分析表明，分离株与牛支原体标准株PG45同源性分别为99.4%和99.6%，而与无乳支原体的同源性仅为98.6%，进一步从基因序列水平上证实了分离株为牛支原体。

2008年以来，我国已有多个省市已证实牛支原体肺炎的流行，本试验首次证实了该病在甘肃省存在，表明该病在我国有逐渐蔓延之势。随着我国奶牛业和肉牛产业的快速发展，牛群的调运将会愈加频繁，牛支原体传播扩散的风险也将提高，应引起各级兽医部门的重视，提高对牛支原体肺炎的认识，加强对该病的防控措施。

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