牛环形泰勒虫病二温式PCR诊断方法的建立及初步应用

王振宝，刘启生，哈 森，何晓杰，刘绪斌，孟 茹，叶尔保勒，巴音查汗＊

（1.伊犁出入境检验检疫局综合技术服务中心，新疆伊宁835000；2.新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐830052；3.伊犁职业技术学院，新疆伊宁835000）

牛环形泰勒虫病是由环形泰勒虫（Theileria annulata）引起的一种蜱传性血液原虫病。该病的传播媒介为璃眼蜱属的多种蜱［1］，是一种季节性很强的地方性流行病，多呈急性经过，发病率和病死率高，对养牛业造成了巨大的经济损失。牛环形泰勒虫寄生于黄牛、水牛、瘤牛、牦牛及犏牛的红细胞和淋巴细胞内。该病分布广泛，主要流行于北美和大多数中亚及南非地区，我国的西北、华北和东北的一些省区也为多发区［2］。目前，对牛环形泰勒虫病的诊断主要采用血液涂片检查法、淋巴结穿刺检查法、间接荧光抗体试验（IFAT）［3］、酶联免疫吸附试验（ELISA）［4］、聚合酶链反应（PCR）［5］等。血液涂片检查法、淋巴结穿刺检查法检出率低，IFAT和ELISA方法可用于检测牛环形泰勒虫抗体，但其敏感性不足以检出所有感染动物，存在着交叉反应现象。PCR方法和DNA探针技术是目前这些方法中特异性最强、敏感性最高的病原检测手段，但国内尚未见报道。

二温式聚合酶链反应，即二温式PCR，又称双温PCR、或二温度点法PCR和二温度梯度PCR，是根据经典PCR技术原理，对标准PCR进行改进，将退火和延伸合并为一个温度，比标准PCR的退火温度高，提高了反应的特异性，缩短了检测时间［6］。Dodson L A等［7］首先在医学检测领域提出并应用，国内最初由阎小君等［8］进行了研究报道。近年该方法应用比较广泛，主要用于水产品、哺乳动物、禽类及植物中病原菌的快速检测。本研究根据PCR技术原理，建立了特异、敏感、简便的牛环形泰勒虫病二温式PCR快速诊断方法，并应用该方法对临床样品进行了诊断。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 虫种及临床样品 牛双芽巴贝斯虫、牛瑟氏泰勒虫、牛伊氏锥虫样品均由新疆农业大学动物医学学院家畜寄生虫学实验室巴音查汗教授提供。临床样品采自牛环形泰勒虫病流行地区的新疆昌吉回族自治州木垒县、吐鲁番托克逊县和博尔塔拉蒙古族自治州达勒特镇，共50份抗凝全血。

1.1.2 试剂 全血基因组提取试剂盒为北京百泰克公司产品；PCR试剂、氨苄青霉素（Amp）、胰蛋白胨、酵母提取物、X－gal、异丙基硫代－β－D 半乳糖苷（IPTG）为上海生工生物工程技术服务有限公司产品；DNA Marker DL 2 000、p MD 18－T 载体、限制性核酸内切酶Bam HⅠ和Hin dⅢ为宝生物工程（大连）有限公司产品；DNA凝胶回收试剂盒为爱思进生物技术有限公司产品；琼脂糖、溴化乙锭为Sigma公司产品；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；试验用水符合GB／T 6682中一级水规格；其余化学试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 PCR诊断方法的建立

1.2.1.1 模板DNA的制备 严格按照全血基因组提取试剂盒说明书进行操作，置于－20℃保存。

1.2.1.2 引物设计与合成 根据 GenBank（登录号：Z48739）已发表的牛环形泰勒虫裂殖子表面抗原（Tams1）基因序列，用Oligo 6.0软件在保守区设计一对特异性引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

上 游 引 物：5′－TGCTGCCCAACCAAAGAT－3′；下游引物：5′－AGCGGAGGTGAACAAAGC－3′。

1.2.1.3 PCR反应体系及循环条件的优化 应用均匀设计方法，采用25μL反应体系对影响PCR反应的主要参数Mg2＋浓度、引物浓度和Tm值进行了优化。

1.2.2 PCR产物的克隆与鉴定分析 将回收纯化的PCR产物与p MD 18－T载体连接，转化到感受态细胞DH5α中，在含氨苄青霉素、IPTG和X－gal的选择性培养基上进行培养，挑取单个白色菌落培养后提取质粒进行PCR和酶切鉴定，将鉴定为阳性的重组质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，并用DNAStar分析软件分析。

1.2.3 特异性试验 分别对牛环形泰勒虫DNA、双芽巴贝斯虫DNA、牛瑟氏泰勒虫DNA和牛伊氏锥虫DNA，采用优化后的最佳反应条件进行PCR扩增。

1.2.4 敏感性试验 对所提取的牛环形泰勒虫DNA用紫外分光光度计测定 OD 260 nm，计算DNA的浓度（原始浓度为34 ng／μL），对该模板进行10倍倍比稀释至10－8，采用优化后的最佳反应条件进行二温式PCR扩增，测定最低模板检测量。

1.2.5 重复性和稳定性试验及临床应用试验 用同一批次提取的牛环形泰勒虫DNA作为模板，进行5次二温式PCR扩增，测定所建立的二温式PCR方法的重复性；分别用不同批次提取的牛环形泰勒虫DNA作为模板，进行5次二温式PCR扩增，测定所建立的二温式PCR方法的稳定性。

1.2.6 两种方法的对比试验 对从新疆牛环形泰勒虫病流行地区采集的50份全血样品分别进行二温式PCR和血涂片诊断，进行结果分析，比较两者阳性检出率。

2 结果

2.1 PCR反应体系及循环条件的优化

应用均匀设计方法优化PCR反应体系为：Mg2＋浓度1.5 mmol／L，d NTPs浓度0.2 mmol／L，引物浓度0.3 mmol／L，模板2μL，Taq DNA聚合酶浓度2.5 U／100μL，灭菌双蒸水补足至25μL；最适反应条件为：95℃5 min；95℃30 s，61℃ 30 s，30个循环；4℃结束反应。PCR产物进行10 g／L琼脂糖凝胶电泳，扩增出大小为154 bp的电泳条带，与目的片段相符，该反应条件下条带清晰，整齐，亮度高，无拖尾现象（图1第9泳道）。

2.2 重组质粒的鉴定

将小量提取的质粒DNA进行二温式PCR扩增，得到一条与预期大小一致的特异性片段（154 bp）（图2）。同时使用Bam HⅠ和Hin dⅢ对重组质粒进行双酶切鉴定，切出了2 502 bp和190 bp的2个片段，与预期片段大小相符（图3）。表明目的基因成功插入载体内。

2.3 重组质粒的序列测定与序列比对

将鉴定为阳性的重组质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，经DNA Star软件分析，基因序列与引物设计时所选（GenBank中登录号为Z48739）片段的相似性为96%（图4）。

2.4 特异性试验结果

将牛环形泰勒虫DNA、牛双芽巴贝斯虫DNA、牛瑟氏泰勒虫DNA和牛伊氏锥虫DNA，分别进行二温式PCR扩增，结果牛环形泰勒虫DNA样品能扩增出大小约154 bp的明亮条带，而其它样品扩增不出任何条带（图5），说明所设计的牛环形泰勒虫DNA的引物有较强的特异性。

2.5 敏感性试验结果

当模板DNA（浓度为34 ng／μL）进行108倍稀释时无扩增产物，即该二温式PCR最低能检测到牛环形泰勒虫DNA浓度为34 fg／μL（图6）。

2.6 重复性和稳定性试验及临床应用试验

用同一批次提取和不同批次提取的牛环形泰勒虫DNA作为模板，分别进行5次二温式PCR扩增，均可扩增出长为154 bp的特异片段，表明重复性和稳定性较好。

图4 PCR扩增产物测序结果Fig.4 The sequencing results of PCR products

2.7 两种方法的对比试验

对采自牛环形泰勒虫病流行区的50份抗凝全血分别进行了二温式PCR和血涂片诊断。二温式PCR的阳性检出率为88%，而血涂片的阳性检出率只有58%（表2），并且血涂片诊断为阳性的样品经二温式PCR诊断均为阳性，表明二温式PCR诊断方法比血涂片诊断方法更为敏感。

表2 二温式PCR和血液涂片诊断结果Table2 The results of two－temperature PCR and blood smears

3 讨论

均匀和正交设计可以解决多因素、多水平试验中的优化问题，与正交设计对比，均匀设计具有试验次数少、布点均匀、结果可靠、易学易用等特点，更适合于像PCR这样多因素多水平实验的优选方案设计［9］。本文是采用均匀设计方法，进行二温式PCR反应体系和循环条件的优化，若运用正交设计，试验处理组合数为162＝256，是均匀设计处理组合数16的水平数16倍，对于水平数高的多因素试验，应用均匀设计显然可以事半功倍。

一般PCR仪的升温速度为4℃／s，60℃到80℃的升温时间约为5 s；Taq DNA聚合酶活性最佳温度为72℃，此温度下的延伸速度为150 bp／s～300 bp／s，60℃～70℃时约为60 bp／s～120 bp／s，对于相对较短的DNA片段（100 bp～200 bp），可将退火、延伸温度合并为一个温度，采用二温式PCR能产生与三步PCR同样多的产物。这可能是由于反应混合物在变性温度和退火温度（94℃～50℃）之间过渡时，已达到了Taq DNA聚合酶的最佳反应温度（70℃～75℃），在这么短的时间内与模板退火结合的引物已经充分延伸形成产物片段。为了获得高特异性而采用高退火－延伸温度，范围可以高于理论温度5℃～10℃，达到60℃～70℃，最佳为68℃。因此，在设计引物时就要有意识的提高Tm值，使引物与模板能准确结合而且稳定性好，以减少非特异扩增［6］。本文所扩增的目的片段大小为154 bp，在进行引物设计时，有意识的提高了退火温度（Tm＝61℃）。

PCR具有良好的特异性，环形泰勒虫30 ku蛋白的基因序列具有良好保守区［10］。Kirvar E 等［11］采用编码环形泰勒虫30 ku蛋白的基因序列设计引物，对带虫牛和蜱体内的环形泰勒虫感染状况检测时，发现该引物不仅敏感性良好，在带虫牛的每微升血液中有1个虫体时即可检出，同时该引物与水牛泰勒虫、小泰勒虫、双芽巴贝斯虫、牛巴贝斯虫、分歧巴贝斯虫也无交叉反应。本文亦采用编码环形泰勒虫30 ku蛋白的基因（Tams1）序列设计引物，建立二温式PCR，经特异性试验表明该检测方法对牛双芽巴贝斯虫、牛瑟氏泰勒虫、牛伊氏锥虫均无交叉反应性；敏感性试验表明该检测方法能检测出牛环形泰勒虫DNA的最低浓度为34 fg／μL。本试验建立的二温式PCR检测方法，以采自牛环形泰勒虫病流行区的抗凝全血作为检样，检测牛环形泰勒虫病阳性率为88%（44／50），而血涂片的阳性检出率只有58%（29／50），其中血涂片检测为阳性的样品经二温式PCR检测均为阳性，因此，二温式PCR检测方法比血涂片检测方法更特异、更敏感，更适合于本病的临床诊断、隐性感染和流行病学调查的研究。

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