IL－18在妊娠早期大鼠下丘脑视前区核团的表达

杜秋婉，司丽芳＊，顾琨涛，赵 鹏，陈树林

（1.河南科技大学动物科技学院，河南洛阳471003；2.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌712100）

IL－18是近年发现的调控型细胞因子，在抗感染、变态反应性疾病及其发病过程中发挥着重要作用［1－5］。在生殖以及免疫调节中也发挥着重要作用［6－7］，Guilbert L［8］认为，妊娠属于一种特殊的 Th2现象，外周血液循环中细胞因子的比率从Thl型转化为Th2型应答，这一现象到妊娠中期达到高峰，IL－18本身是一种参加机体免疫应答的细胞因子，在妊娠这种半同种异体移植过程中发挥着重要作用。IL－18能够调节子宫内膜NK细胞的产生、募集及激活，可以促进先天免疫，依赖细胞因子的微环境途径调节Th1和Th2型免疫反应。研究表明，健康妊娠妇女外周血液中单核细胞分泌的IL－18／IL－12值与非妊娠妇女相比明显增高，并且IL－12的分泌减少或IL－18分泌增加均可诱发Th2型优势，有利于妊娠过程的维持。子宫腔内分泌物中IL－18是否存在是预测胚胎植入成败的指标之一，因此IL－18与妊娠维持有着非常密切的关系［6］。本试验利用免疫组织化学技术和图像分析方法，全面研究了大鼠胚泡植入前后期下丘脑视前区与妊娠调控有关的核团中IL－18的表达，以探讨IL－18在胚胎植入前后对妊娠调控发挥的重要作用，为进一步阐明IL－18及其相关调控因子在妊娠调控中的作用及其提高胚胎的植入率提供形态学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

健康性成熟的雌雄SD大鼠，体重200 g左右，购自河南省实验动物中心，常规实验室饲养管理，1周以后用于试验。发情期鉴定采用阴道涂片方法检测，取处于发情期的雄性大鼠与雌性大鼠1∶1合笼过夜。次日清晨逐一检查合笼雌鼠，发现雌鼠有阴道栓或精子者即定为妊娠D1。本试验妊娠大鼠随机分为2组：植入后期（妊娠D9）妊娠大鼠和 植入前期（妊娠D4）妊娠大鼠，每组10只。

1.2 方法

1.2.1 取材及其切片 各试验组妊娠大鼠均在上午9时处死同时取出下丘脑，随后迅速置于多聚甲醛磷酸缓冲液（40 mL／L）中后固定12 h～24 h之后，移入4℃、200 g／L蔗糖的PB液中直至组织块沉底即可。对固定后的下丘脑做连续的冠状组织切片，片厚大约35μm，取其中的3套切片。第一套切片用于免疫组化SP法染色；第2套用于Nissl法染色，以用于下丘脑的核团定位；第3套组织切片用PBS液代替一抗，用作阴性对照。

1.2.2 主要试剂及其免疫组化操作步骤 一抗采用兔抗鼠的IL－18多克隆抗体（行1∶100稀释，武汉博士德公司产品），阴性对照组切片采用0.01 mol／L PBS缓冲液体代替一抗，用DAB试剂显色并贴片，用梯度酒精行脱水，二甲苯透明后在光学显微镜下观察。

1.2.3 结果判断及其统计学处理步骤 呈现蓝色的阳性反应颗粒为阳性，细胞质均不显色呈现阴性表达。随机在切片中选取10个部位相同但切片不同的高倍镜视野（400×），用高清晰的图像分析系统软件对图片进行分析，计算所观察切片的每个视野中阳性细胞的阳性强度均值（阳性强度的结果用平均吸光度表示）及其阳性面积，最后计算出阳性产物的相对表达量μ2均值（即μ2＝阳性强度均值×阳性面积×光镜倍数／260 000）［9］，其中260 000表示像素。计量的资料结果用平均值±标准差即（¯X±SD）表示，数据用SPSS11.5统计分析软件进行分析统计，采用t检验方法比较各试验组组大鼠下丘脑中IL－18的表达，P＜0.05为差异有显著的统计学意义；P＜0.01为差异有极显著的统计学意义。

2 结果

2.1 IL－18在植入后期及植入前期大鼠下丘脑视前室周核的阳性表达

植入后期妊娠大鼠下丘脑视前室周核中阳性产物呈蓝色或蓝黑色强阳性表达，阳性胞体内深蓝色的阳性颗粒融合为团块状，阳性产物染成一片，使得阳性细胞体的轮廓清晰。在阳性细胞中，阳性产物均定位在细胞质和细胞核。中等阳性表达的细胞内呈蓝色的阳性产物均匀分布，阳性反应的细胞多为聚集或分散存在于视前室周核，阳性细胞呈现出不规则的圆形、卵圆形以及梭形等（图1A）。在植入前期的大鼠下丘脑视前室周核中弱阳性表达者阳性反应产物呈现蓝色，阳性表达细胞的胞体轮廓模糊不清，在高倍视野下方可看到有少许呈浅蓝色反应的阳性颗粒。且阳性细胞多呈现不规则的圆形及其卵圆形并且数量较少（图1B），阳性表达量与植入后期相比表达显著降低（P＜0.05）（表1）。

2.2 IL－18在植入后期及植入前期大鼠下丘脑视前内侧核的阳性表达

在植入后期妊娠大鼠下丘脑的视前内侧核可见多数细胞呈现强阳性的表达，阳性产物多定位于胞质及胞核。阳性细胞呈现圆形或卵圆形，多聚集或分散存在。阳性细胞内蓝色的阳性颗粒密集，阳性颗粒间相互融合呈蓝黑色的团状结构（图1E）。植入前期大鼠的下丘脑视前内侧核中阳性产物多为弱阳性表达且为蓝色，胞体呈圆形或者卵圆形，阳性细胞体数量较少并且细胞体间轮廓不清（图1F），植入前期阳性表达的强度与植入后期相比较其差异显著降低（P＜0.01）（表1）。

图1 下丘脑视前外侧核及其视前室周核和视前内侧核内IL－18的阳性表达 （400×）Fig.1 Expression of IL－18 in nucleus pre－opticus medialis and nucleus pre－opticus mango cellularis and nucleus pre－opticus periventricularis of hypothalamus（400×）

表1 IL－18在妊娠大鼠下丘脑内的表达Table1 The expression of IL－18 in hypothalamus of pregnant rats

2.3 IL－18在植入后期及其植入前期大鼠下丘脑视前外侧核的阳性表达

在植入后期大鼠下丘脑视前外侧核中均可见多数阳性细胞相互密集分布，阳性颗粒在阳性细胞内融合成团状结构，阳性产物呈现出蓝黑色或蓝色的强阳性表达。阳性细胞体大多呈现圆形及其卵圆形（图1C）。植入前期大鼠下丘脑的视前外侧核内阳性产物多为弱阳性表达而且数量较少。阳性表达的细胞多为分散存在，阳性胞体多呈圆形且较小（图1D），在下丘脑视前外侧核IL－18的阳性表达强度与植入后期相比较也显著降低（P＜0.05）（表1）。

2.4 IL－18在植入前期及植入后期大鼠下丘脑视前区其他核团的表达

在下丘脑视前区的其他核团如视交叉上核、视上核、视前大细胞核、弓状核也有较多的IL－18阳性产物表达，且阳性表达量及表达强度植入后期与植入前期相比，植入后期均高于植入前期（表1）。

3 讨论

妊娠的建立、妊娠过程的维持及其分娩启动均与多种细胞因子调控密切有关，其中Th1／Th2型细胞因子水平能否平衡与妊娠的关系最为重要，二者在体内的平衡状态将决定着妊娠的结局。正常的妊娠状态下Th1／Th2型细胞因子的比例偏向于Th2型漂移，这种漂移将有利于胎儿及其附属物的生长发育。分娩发动与体内Th1／Th2型细胞因子的平衡也密切相关［10－11］。妊娠过程中的母体和胎儿之间存在着及其复杂的免疫调节关系，流产是免疫排斥的一种表现形式。IL－18本身是一种妊娠调控因子是Okamura H等［12］于1995年从内毒素休克小鼠的肝细胞中克隆出的分子质量为18 ku～19 ku的活性物质，近年来多数的研究均发现IL－18在生殖调控中发挥着极其重要的作用，其表达异常将会导致生殖系统疾病的产生。IL－18在Th1／Th2型细胞因子的平衡调控中也发挥着重要的调控作用［13］。Ostojic S等［14］研究表明，IL－12／IL－18参与妊娠机体子宫中 NK 细胞的调控及血管发育，IL－12／IL－18的基因多态性将会变更细胞因子间的平衡，从而增加妊娠机体自然流产的发生率。

IL－18 在免疫细胞［15］以及内分泌细胞［16］中均有一定的表达，也是一种在内分泌系统和免疫系统之间发挥调控作用的免疫调节因子之一。有报道表明，下丘脑IL－18的水平如果降低，垂体的内分泌功能将会减弱，最终导致妊娠期间子宫功能发挥异常，从而对子宫内胚胎的存活不利［17］。本研究结果表明，IL－18在胚泡植入前后期妊娠大鼠下丘脑视前区的视上核、视前大细胞核、视前交叉上核、视前室周核、视前内侧核、视前外侧核以及弓状核均广泛分布，且植入后期的表达较强于植入前期，表明在胚泡植入的前后期，IL－18通过下丘脑的反馈功能对妊娠调控发挥着及其重要的作用，IL－18与妊娠的维持及其妊娠的建立有着密切关系，IL－18在胚泡植入前、后期对妊娠的调控功能不仅体现在调控胚胎的存活方面，在胚胎的生长方面也有一定的调控作用。在正常有机体的妊娠过程中IL－18可能还会与其它细胞因子相互协调，共同维持妊娠这一生理活动的正常发展。

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