湖北省羊口疮病毒的分离鉴定

王光祥，尚佑军，陈江涛，吕占禄，张克山，刘湘涛

（中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室，甘肃兰州730046）

羊口疮（Orf）亦称羊传染性脓疱、羊传染性脓疱皮炎、羊传染性脓疱口炎，是由羊口疮病毒（Orf virus）引起的一种人兽共患接触性传染病。本病最早于1920年发现于欧洲，现已广泛分布于全世界，以澳大利亚、新西兰等国最为严重。我国吉林、甘肃、内蒙古、陕西、西藏、四川、云南等主要养羊省区均有本病发生的报道。本病的病原为痘病毒科副痘病毒属成员，可在牛和山羊的胚肾细胞、犊牛和羔羊的睾丸细胞培养中生长［1－3］。近年来，随着养羊业的发展，羊只引种等交易频繁，加速了该病在我国各省的发生，给养羊业带来巨大的经济损失。

2009年11月中旬，湖北省通山县某羊场有300多只1月～3月龄黑山羊羔羊发病，发病率达80%，主要表现为典型的口疮症状，经多种抗生素和驱虫药治疗无效，1周后有40多只病羊死亡。为了查明病因并获得致病毒株，本试验对病毒进行了系统的分离鉴定，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株、病料 MDBK细胞株由本实验室保存，病料采自湖北省通山县某羊场发病山羊疑似羊口疮唇部痂皮。

1.1.2 实验动物 昆明乳鼠、3月龄兔子由本所动物场提供，6月龄黑山羊羔羊购自甘肃省某羊场。

1.1.3 试剂 LA Taq DNA 聚合酶、DNA 分子质量标准、DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒均为宝生物工程（大连）有限公司产品；DMEM高糖培养基、胎牛血清为Hyclone公司产品；其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 病料处理 取痂皮病料用无菌生理盐水漂洗3次后剪碎、研磨并以无菌生理盐水按1∶10（V／V）制成悬液，加青霉素、链霉素各2 000单位／mL，置－20℃冻融2次后4℃浸毒过夜，以3 000 r／min离心20 min，取上清液经菌检阴性后置－20℃备用。

1.2.2 病毒分离 挑选长成致密单层且形态完好的MDBK细胞，用提前预热至37℃的DMEM液清洗细胞1次～2次，接种1.2.1处理好的病毒液1 mL，37℃感作30 min，加入DMEM维持液37℃继续培养并逐日观察细胞生长情况和细胞病变，同时设正常细胞对照。当细胞出现75%细胞病变时收毒，冻融3次后继续传代。若细胞在接种病料后4 d～5 d内未出现病变则连续盲传3代，若第5代仍未病变视为阴性。

1.2.3 病毒理化学特性试验 取13代细胞病毒液，用5－IUDR（5－碘－2－脱氧尿苷）处理病毒液进行病毒核酸类型鉴定；用200 mL／L乙醚和50 mL／L氯仿处理病毒液进行脂溶剂敏感试验；50℃水浴30 min进行病毒耐热性试验。分别用MDBK细胞在96孔板上测定病毒的TCID50，未处理的正常细胞设为对照。

1.2.4 动物接种试验 将1.2处理并保存的痂皮毒液分别接种以下动物［4－5］：①乳鼠：皮下注射2日龄昆明乳鼠，0.1 mL／只，各接种5只，另设注射同剂量生理盐水的5只乳鼠作对照。②家兔：背部及股内侧皮肤经剪毛消毒后划痕接种、腹部作皮内注射待检上清液，2 mL／只，各3只，另设注射同剂量生理盐水的3只家兔作为对照。③羊：选3只6月龄黑山羊羔羊，将病料悬液划痕接种口唇黏膜，背部及股内侧皮内注射待检上清液，共4处，每处接种0.5 mL，另设注射同剂量生理盐水的1只羔羊作为对照。

1.2.5 分离毒株TCID50的测定 在96孔细胞培养板内培养MDBK单层细胞，将传代细胞毒6代～17代细胞毒分别用常规方法测定TCID50，最后用Reed－Muench法计算 TCID50。

1.2.6 PCR测序及序列分析 根据GenBank中ORFV B2L基因序列 （登 录 号：GQ328006.1，GU139356.1，GU320351.1），用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0软件设计扩增引物：P1：AAGGATCCATGTGGCCGTTCTCCTC； P2： ATCGCCGGCGTTAATTTATTGGTTTGC。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2.7 分离毒PCR鉴定 用宝生物工程（大连）有限公司DNA提取试剂盒，按说明书从病料痂皮和传代细胞病毒液中（第1代至第3代）提取DNA。以提取的病毒基因组DNA为模板，采用50μL的PCR反应体系（LA Taq（5 U／mL）0.5μL；10×LA PCR buffer 5μL；d NTP （2.5 mmol／L）8μL；B2L上下游引物P1、P2各0.5μL；DNA 模板5μL；d H2O 30.5μL），扩增目的片段。反应条件为95℃2 min；95℃1 min，59℃30 s，72℃1 min 30 s，35个循环；72℃10 min。取8μL PCR产物在8 g／L琼脂糖凝胶上电泳，检测扩增结果。回收PCR产物送宝生物工程（大连）有限公司测序。将测序结果进行BLAST比对分析，同时应用DNA Star软件的Meg Align软件对分离株B2L基因的测序结果进行生物信息学分析。

2 结果

2.1 病毒分离及传代结果

病料悬液接种MDBK细胞后从第一代细胞出现细胞病变，病变时间出现在40 h左右，继续传到6代细胞病变时间更加规律，细胞病变时间出现在36 h以后，细胞病变表现为：胞核浓缩、变圆、团聚、拉网、最后脱落的现象（图1和图2）。对照细胞正常，收毒时间都维持在72 h以内。继续传代至17代细胞病变规律，且随着传代次数的增加出现细胞病变也更加规律，将该病毒分离株命名为ORFV／HB／09。

图1 MDBK对照细胞Fig.1 MDBK control cell

图2 MDBK细胞产生细胞病变Fig.2 Cytopathic effect in MDBK cells

2.2 理化学鉴定结果

将第13代细胞毒经5－IUDR、200 mL／L乙醚、50 mL／L氯仿、55℃水浴处理后，测定的TCID50分别为10－3.5、0、0、10－2.0，与未经处理的相应病毒液的 TCID50（10－5.2）相比，经处理的病毒液的 TCID50均有不同程度的降低。

2.3 动物接种试验

接种乳鼠，观察1周，与对照相比均未产生明显的临床症状；接种家兔3 d后，在接种部位未出现水泡和脓疱，只出现丘疹状红斑；接种病料的羊只在接种后第2 d，在划线接种部位出现红斑，红斑逐渐变为丘疹和小结节，继而成为水疮。在接种后第4天唇部出现脓泡，而后形成疣状硬痂（图3）。

2.4 分离株各代次传代细胞毒TCID50测定结果

分离株随传代次数的增加，病毒在MDBK细胞中的感染滴度逐步升高，但传代至13代后病毒滴度增加缓慢，趋于稳定（表1）。

2.5 PCR检测结果及序列分析

以分离株第1代至第3代和原病料痂皮分别提取的病毒基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增出1 137 bp左右的目的基因片段，与预期的片段长度相符（图4）。将该片段回收并测序，测序结果经BLAST核酸序列搜索后与测序结果相似性较高的20个病毒核酸序列均为ORFV核酸序列。相似性最高的序列为台湾株（EU935106.1、DQ904351.1），相似性均为99.0%。

图3 接种山羊发生严重羊口疮Fig.3 Severe orf lesions in inoculated goats

表1 分离株在MDBK细胞上的TCID50测定结果Table1 The results of isolated strain TCID50 in MDBK cell

将该分离株B2L基因全序列测序结果与国内外发表的ORFV毒株相应序列进行比较，应用DNA Star软件包中 Meg Align软件的 Clustal V方法计算遗传距离，根据遗传距离绘制核苷酸系统发育进化树（图5）。BL21基因进化树结果表明，与山羊分离株（EU935106.1）（DQ904351.1）的亲缘关系较近。同时，与分离株同处于一个进化分支上的毒株均来源于山羊，另一大的分支上的毒株均来源于绵羊。

3 讨论

病原分离鉴定是诊断羊口疱病的金标准，本试验用MDBK细胞从自然发病山羊羔羊的痂皮病料中分离出1株病毒，传代至17代，病毒传代细胞病变良好。病毒理化学特性试验结果表明，5－碘－2－脱氧尿苷（5－IUDR）对病毒有明显的抑制作用，病毒对脂溶剂敏感、不耐酸碱、对温度有一定的抵抗力、反复冻融毒价下降，表明该病毒核酸属DNA型。PCR产物测序结果分析表明，我们检测到了特异性的ORFV B2L基因，结合动物回归试验结果证明所分离到的细胞毒株为痘病毒科副痘病毒属的羊口疮病毒。

回归试验结果表明细胞适应毒能引起羔羊出现典型的羊口疮症状，与临床见到的病例吻合。本研究中临床发病均为哺乳期羔羊或断奶羔羊，未见成年羊。用该分离毒接种乳鼠未见临床病变，这与国内报道的相符［5］。同时用该分离毒接种家兔，在接种部位只出现丘疹状红斑，未出现水泡和脓疱，这可能是由于该分离毒毒力较弱所致。另外，本试验用MDBK细胞分离的毒株，在经细胞传代时，前13代病毒滴度增加较快，但13代后病毒滴度增加较慢，13代～17代毒病毒滴度在5.5左右，趋于稳定，病毒滴度不高。而分离羊口疮病毒一般常用的细胞是牛、羊睾丸原代细胞，分离的病毒病毒滴度可达到6.0以上［5－7］。造成病毒滴度不高的原因是由于所选用的细胞系不同，还是由于毒株的原因有待于通过毒株对比试验和在分子水平对其毒力基因进行分析等进一步证实。

该分离株与其他国内外参考毒株B2L基因相应部分核苷酸序列相似性比较结果表明，不同来源、不同分离株的B2L基因高度保守。因此，B2L基因可以作为羊口疮病毒分子诊断靶基因，同时也可将该基因表达产物应用于血清学诊断。

图5 ORFV／HB分离株B2L基因的进化树分析Fig.5 Phylogenetic tree of B2L gene of ORFV／HB

目前，世界各国特别是养羊业发达的国家，已用分子生物学的方法进行疾病诊断，并加紧进行病毒分子生物学研究和基因工程苗的研究工作［8－10］。我们利用MDBK细胞对羊口疮病毒进行了分离鉴定，成功分离到一株羊口疮病毒，为今后进一步研制羊口疮疫苗和检测试剂打下了良好的基础，进而为该病的防控提供了技术保障。

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