4种经济海藻脂肪酸组成分析

张 敏, 李瑞霞, 伊纪峰, 沈颂东, 胡传明, 应上云, 汤 俊, 张 涛,许 璞

（1. 苏州大学 医学部 基础医学与生物科学学院, 江苏 苏州 215123; 2. 常熟理工学院 生物与食品工程学院,江苏 常熟 215500; 3. 江苏省海洋与水产研究所, 江苏 南通 226007）

4种经济海藻脂肪酸组成分析

张 敏1, 李瑞霞1, 伊纪峰2, 沈颂东1, 胡传明3, 应上云2, 汤 俊2, 张 涛2,许 璞2

（1. 苏州大学 医学部 基础医学与生物科学学院, 江苏 苏州 215123; 2. 常熟理工学院 生物与食品工程学院,江苏 常熟 215500; 3. 江苏省海洋与水产研究所, 江苏 南通 226007）

采用改进的 Bligh-Dyer法提取脂溶性成分, 气相色谱-质谱联用法（GC-MS）进行分离和鉴定,C19:0内标确定总脂及各组分含量, 研究了鼠尾藻（Sargassum thunbergii）、浒苔（Enteromorpha prolifera）、龙须菜（Gracilaria lemaneiformis）和红毛菜（Bangiasp.）4种经济海藻的脂肪酸组成及含量。结果表明, 4种海藻都检测出C14-C22脂肪酸, 总脂含量在12～19 mg/g之间, 不饱和脂肪酸为主要组成成分,含量均超过60%。不饱和脂肪酸中以多不饱和脂肪酸（PUFAs）为主, 富含n-3和n-6系列PUFAs, n-6与n-3系列PUFAs之比均低于2。比较4种海藻脂肪酸组成特点表明, 鼠尾藻以C16、C18和C20为主要组成成分, 具褐藻类脂肪酸组成特征; 浒苔以C16和C18为主要组成成分, 具绿藻类脂肪酸组成特征;龙须菜和红毛菜以C16和C20类脂肪酸为主, 具典型红藻类脂肪酸组成特征, 同时二者又有不同之处,分别显示真红藻与原始红藻脂肪酸组成的特点。

鼠尾藻（Sargassum thunbergii）; 浒苔（Enteromorpha prolifera）; 龙须菜（Gracilaria lemaneiformis）; 红毛菜（Bangiasp.）; 脂肪酸; 气相色谱质谱法

海藻是重要的海洋生物资源, 种类丰富, 在我国已记录800种左右, 其中有经济价值的有100多种,主要是褐藻、红藻和绿藻等大型种类[1-2]。鼠尾藻（Sargassum thunbergii）隶属褐藻门（Phaeophyta）, 在我国北起辽东半岛南至雷州半岛都有分布, 是我国海洋野生植物中极为丰富的大型经济海藻[3]。浒苔（Enteromorpha prolifera）属绿藻门（Chlorophyta）, 广泛分布于我国南北海区, 是资源丰富的绿藻资源[4]。龙须菜（Gracilaria lemaneiformis）和红毛菜（Bangiasp.）同属红藻门（Rhodophyta）, 分属真红藻亚纲（Florideophycidae）和红毛菜亚纲（Bangioideae）。龙须菜产于我国北方沿海, 以山东沿海分布较多[6]; 红毛菜是海洋原始藻类的代表, 在我国南北方沿海都有分布, 以东南沿海为多[5]。龙须菜和红毛菜都是重要的经济栽培海藻。

脂肪酸是一端含有一个羧基的长脂肪族碳氢链有机物, 依据饱和度的不同, 分为饱和脂肪酸（SFA）、单不饱和脂肪酸（MUFA）和多不饱和脂肪酸（PUFA）[7]。海藻脂质含量较低, 一般为0.1%～1.0%,但不饱和脂肪酸（UFA）含量较高, 尤其富含n-3和n-6系列PUFAs, 是PUFAs的重要来源[8-9]。丹麦科学家Dyerberg[10]1978年报道, n-3系列PUFAs具有抗动脉粥样硬化、血栓、高血脂和高血压以及消除炎症等重要生理活性, 引起人们对不饱和脂肪酸研究的广泛关注[7]。Kaneniwa等[11]对海藻多不饱和脂肪酸组成的研究, 发现其具丰富的 n-3和 n-6系列 PUFAs,n-6/n-3PUFAs比率低。Jamieson等[12]、Khotimchenko等[13-14]分别报道了不同种属常见海藻的脂肪酸组成特点, 认为脂肪酸组成具有种属特征, 红藻主要含C16和C20类脂肪酸, 绿藻主要是C16和C18类脂肪酸,褐藻主要有C16、C18和C20类脂肪酸。蔡春等[15]、李宪催等[16]在对我国海藻脂肪酸分析研究中, 也报道了多种海藻的脂肪酸组成具有种属特异性的特点[15-16]。

本研究以大型海藻中的重要经济物种为对象,分析不同种属海藻脂肪酸组成特征以及差异性, 重点比较n-3和n-6系列PUFAs在经济海藻中的组成特点, 以期为了解海藻资源特点及其进一步开发利用提供基础性资料。

1 材料与方法

1.1 材料及前处理

测试材料采集于2010年春季, 龙须菜和鼠尾藻采自青岛海区自然生长藻体, 红毛菜和浒苔在黄海南部海区的紫菜栽培伐架上采摘获取。上述材料采用低温法带回实验室, 洁净海水清洗, 剔除杂藻杂物, 蒸馏水漂洗 3次, 低温风干, 研磨, 100目过筛,−20℃保存备用。

1.2 脂肪酸提取

采用改进的 Bligh-Dyer（m-BD）法[17]进行脂肪酸提取。0.2 g藻粉, 加入10 mL混合比例为1:2:0.8的氯仿、甲醇和蒸馏水溶剂, 匀浆, 加入C19:0内标40 μg, 40 KHz超声处理5 min, 5 000 g离心5 min, 收集上清。沉淀部分重复上述操作, 共提取3次, 合并上清, 加入等体积混合比1:1的氯仿和蒸馏水溶液, 使其终浓度为氯仿:甲醇:蒸馏水= 1:1:0.9。加入 1 mL 5%氯化钠混匀, 静置。上层为水相, 含盐类和水溶性物质, 下层为氯仿层, 氯仿层转至旋转蒸发仪, 旋转干燥, 获得总脂肪酸。

在上述脂肪酸测样中, 加入 1 mL 1.5%（W/V）NaOH/CH3OH溶液, 55℃水浴保温15 min, 再加入2 mL 5%（V/V）HCl/CH3OH溶液, 继续55℃水浴保温20 min。取2 mL正己烷, 加入上述反应体系混匀, 静置分层, 吸出上层正己烷相, 再向下层水相中加入 2 mL正己烷, 重复上述步骤, 合并 3次吸出液, 于旋转蒸发器内蒸干, 1 mL正己烷定容, 待分析。

1.3 GC-MS分析条件

仪器: QP2010气相色谱-质谱分析仪, AOC-20i自动进样器（日本 SHIMADZU 公司）, 30 m×0.25 mm×0.25 um RTX-Wax色谱柱（美国SUPELCO公司）。

GC条件: 进样口温度220℃, 检测器温度250℃,载气为高纯氦气（99.999%）, 柱流速 1.0 mL/min, 进样时间1 min, 溶剂延迟3 min, 柱起始温度60℃, 保持 2 min, 以 15℃/min升温至 120℃, 然后以2.5℃/min升温至220℃, 保持15 min。采用分流进样模式, 分流比50:1, 进样量1 μL。

MS条件: 电子轰击（EI）离子源, 电子能量 70 eV,离子源温度 230℃, 接口温度 220℃, 选取全程离子碎片扫描（SCAN）模式, 质量扫描范围为 45～450 m/z。

1.4 统计分析

实验设置 3个重复, 实验数据表示为平均值±标准差（n=3）。脂肪酸含量的计算先采用内标法计算实际含量, 然后换算成百分含量。应用统计软件Origin7.0对实验数据进行标准误差分析。

2 结果

2.1 总离子流图谱

鼠尾藻、浒苔、龙须菜和红毛菜的脂肪酸成分总离子流图（图1、2、3、4）显示, 4种经济海藻含有C14-C22的脂肪酸, 其脂肪酸组成相似。各脂肪酸组分按出峰顺序依次为C14:0、C15:0、C16:0、C16:1、C17:0、C18:0、C18:1、C18:2、C18:3、C20:0、C20:1、C20:2、C20:3、C20:4、C20:5、C22:0、C22:1和 C22:5,所有组分在保留时间55.0 min内均达到基线分离。

内标C19:0出峰时间在39.5 min。

图1 鼠尾藻脂肪酸甲酯总离子流色谱图Fig. 1 TIC of fatty acid methyl esters from S. thunbergii

图2 浒苔脂肪酸甲酯总离子流色谱图Fig. 2 TIC of fatty acid methyl esters from E. prolifera

图3 龙须菜脂肪酸甲酯总离子流色谱图Fig. 3 TIC of fatty acid methyl esters from G. lemaneiformis

2.2 脂肪酸组分

根据气相色谱-质谱总离子流图中各组分的离子碎片质量谱图, 通过NIST05及NIST05s谱图库检索,结合标准谱图确认其成分, 同时采用内标法测得总脂及各组分含量。定性、定量结果如表1。

图4 红毛菜脂肪酸甲酯总离子流色谱图Fig. 4 TIC of fatty acid methyl esters from Bangia sp.

表1 4种海藻脂肪酸组成及相对含量Tab. 1 The compositions and relative contents of fatty acids in the four algae

2.3 总脂含量

4种海藻总脂含量如图5所示。鼠尾藻中鉴定出21种脂肪酸, 总脂含量 13.54 mg/g; 浒苔鉴定出 19种脂肪酸, 总脂在 4种海藻中最低, 为 12.64 mg/g;龙须菜和红毛菜均鉴定出18种脂肪酸, 二者总脂含量相对较高, 分别为16.99 mg/g和18.28 mg/g。4种海藻总脂含量的范围在12～19 mg/g之间。

图5 4种海藻总脂含量Fig. 5 The total lipid contents in the four algae

2.4 SFAs、UFAs含量及组成

4种海藻SFAs都以 C16:0为主, 而UFAs组成有明显差异。鼠尾藻 UFAs主要是 C18:1（n-9）、C18:2（n-6）、C18:3（n-3）、C20:4及 C20:5; 浒苔 UFAs组分主要为 C18:1（n-7）、C18:2（n-6）及 C18:3（n-3）; 龙须菜UFAs以C20:4和C20:5为主, 红毛菜C20:5含量显著, 高达 42.89%。4种海藻 SFAs范围在31.80%～39.95%之间, UFAs在 60.05%～68.20%之间, SFAs与UFAs含量之比在1:2左右（图6）。

图6 4种海藻SFAs与UFAs相对含量Fig. 6 The relative contents of SFAs and UFAs in the four algae

2.5 n-3和n-6系列PUFAs含量及组成

4种海藻n-3和n-6系列PUFAs组成如图7所示。鼠尾藻PUFAs占总脂的44.26%, 其中n-3系列含量占总脂 20.45%, n-6系列占 23.06%, n-6/n-3系列PUFAs之比为1.13; 浒苔的PUFAs占总脂的37.86%,n-3系列含量占总脂 27.54%, n-6系列占 8.79%,n-6/n-3系列PUFAs比值为0.32; 龙须菜中PUFAs占总脂含量的45.32%, n-3系列含量为总脂的26.33%,n-6系列为18.75%, n-6/n-3系列PUFAs比例为0.71;红毛菜PUFAs含量相对较高, 占总脂含量的54.51%,n-3系列 PUFAs相对含量为 43.09%, n-6系列为11.41%, n-6/n-3系列PUFAs之比为0.27。

图7 4种海藻n-6及n-3系列PUFAs相对含量Fig. 7 The relative contents of n-6 and n-3 PUFAs in the four algae

3 讨论

3.1 4种海藻脂肪酸组成特征

海藻脂肪酸组成具有种属特异性[12-16]。红藻主要含十六碳SFAs和二十碳PUFAs, 几乎不含二十二碳 PUFAs[18]。绿藻以十六碳 SFAs和十八碳 UFAs为主, 含有微量的二十碳 PUFAs, 具有较高含量 α-亚麻酸是绿藻脂肪酸组成的突出特征[19]。褐藻所含脂肪酸种类较红藻和绿藻丰富, 以十六碳 SFAs、十八碳UFAs和二十碳PUFAs为其脂肪酸主要组分[14]。本文测试结果显示, 鼠尾藻所含脂肪酸种类较浒苔、龙须菜和红毛菜丰富, 其中 C16:0、C18:1（n-9）、C18:2（n-6）、C18:3（n-3）、C20:4和C20:5是主要成分,占总脂肪酸的一半左右; 浒苔以C16:0、C18:1（n-7）、C18:2（n-6）及 C18:3（n-3）为主, 含有微量的二十碳PUFAs（C20:4和 C20:5）, 具有较高含量 α-亚麻酸（C18:3 n-3）; 龙须菜和红毛菜以 C16:0、C20:4和C20:5为主, 几乎不含二十二碳PUFAs。4种海藻脂肪酸组成特点与前人对海藻脂肪酸的研究报道相似,鼠尾藻具褐藻类脂肪酸组成特征, 浒苔表现绿藻的脂肪酸组成特征, 龙须菜和红毛菜显示典型的红藻脂肪酸组成特征。

一般认为, 红藻脂肪酸组成是有相对高的十六碳 SFAs和二十碳 PUFAs（C20:4和 C20:5）[18]。本研究结果表明, 红毛菜与龙须菜在二十碳 PUFAs组成上有明显差异, 龙须菜C20:4和C20:5相对含量都较高, 而红毛菜以 C20:5为主要组分, 仅含微量的C20:4。马家海等（2002）[22]报道红毛菜脂肪酸 C20:5含量高达51.74%, Kayama等[20]、陈人弼等[21]报道条斑紫菜和坛紫菜的二十碳PUFAs也都以C20:5为主,其含量超过50%, 仅含微量C20:4。而仙菜目、隐丝藻目、杉藻目和海索面目等真红藻则富含 C20:4和C20:5[15-16]。根据已有研究结果可以认为, 二十碳PUFAs中C20:4和C20:5的相对含量水平是真红藻和原始红藻脂肪酸组成的区分特征。

3.2 4种海藻n-3与n-6系列PUFAs组成特点

n-3与n-6系列多不饱和脂肪酸含量及其比值是衡量脂肪酸价值的重要指标, 特别是n-3系列PUFAs在人体的营养、发育和健康等方面起着重要作用[8-9]。紫菜、浒苔、马尾藻和江蓠等经济海藻的脂肪酸组成中, 都富含n-3与n-6系列PUFAs, 尤其是n-3系列的EPA和DHA, 这些海藻中n-6与n-3系列PUFAs相对含量的比率均低于3[21-26]。紫菜属和红毛菜属海藻含有丰富的n-3系列PUFAs, EPA占到总脂肪酸的50%左右[20-22]。本研究中浒苔、江蓠和红毛菜含有较高 n-3系列 PUFAs, 其中又以红毛菜的 n-3系列PUFAs含量显著, 鼠尾藻虽含有较高的 n-6系列PUFAs, 但4种经济海藻n-6与n-3系列PUFAs比率均低于2。人类膳食结构中n-3 PUFAs相对缺乏[27],联合国卫生组织WHO[28]推荐饮食中n-6/n-3摄入比例应低于 4～5。本文研究结果表明, 经济海藻富含n-3系列 PUFAs, 并且 n-6/n-3比例符合健康膳食的要求, 具有良好的开发利用前景。

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Received: Dec.,17,2010

Key words:Sargassum thunbergii; Enteromorpha prolifera; Gracilaria lemaneiformis; Bangia sp.; fatty acid; GC-MS

Abstract:The fat-soluble components were extracted using a modified Bligh-Dyer method, which were further separated and identified by gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）, with C19:0 as internal control. The fatty acid composition of four economic algaes includingSargassum thunbergii,Enteromorpha prolifera,Gracilaria lemaneiformisandBangiasp. were determined. The C14-C22 fatty acids were detectable in all of the four algae with total lipid contents varying between 12-19 mg/g. The unsaturated fatty acids were the main components among the fatty acids, which accounted for more than 60%. The polyunsaturated fatty acids （PUFAs）, especially the n-6 and n-3 PUFAs, were the main components among the unsaturated fatty acids. The content ratios of n-6/n-3 PUFAs were all less than 2. The comparison of fatty acid composition showed that fatty acid designated C16, C18 and C20 were the major composition inS. thunbergii, exhibiting typical fatty acid composition characteristic of brown algae. C16 and C18 were the major fatty acid composition inE. prolifera, the typical characteristic of green algae. BothG. lemaneiformisandBangiasp. mainly contained C16 and C20, which was the typical characteristic of red algae. Meanwhile,G. lemaneiformisandBangiasp. exhibited typical composition characteristic of Florideophycidae and Bangioideae, respectively.

（本文编辑:康亦兼）

Analysis of the fatty acid composition of four economic seaweeds

ZHANG Min1, LI Rui-xia1, YI Ji-feng2, SHEN Song-dong1, HU Chuan-ming3,YING Shang-yun2, TANG Jun2, ZHANG Tao2, XU Pu2

（1. School of Medicine and Life Sciences, Medical College of Suzhou University, Suzhou 215123, China; 2. Department of Biology and Food Engineering, Changshu Institute of Technology, Changshu 215500, China; 3. Marine Fisheries Institute of Jiangsu Province, Nantong 226007, China）

Q547

A

1000-3096（2012）04-0007-06

2010-12-17;

2011-06-10

国家863计划项目（2006AA10A413）资助

张敏（1983-）, 女, 山东临沂人, 硕士研究生, 研究方向为细胞生物学, 电话: 15020351146, E-mail: zhangmin840818@163.com