维生素A、D对肉鸡钙磷代谢相关激素水平的影响

曹 平孙建萍闫素梅 方丽惠,3史彬林郭晓宇付果花

（1.内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古呼和浩特 010018；2.锡林郭勒职业学院，内蒙古锡林浩特 026005；3.包头师范学院，内蒙古包头 014030）

骨骼代谢障碍是降低肉鸡生产中经济效益的重要因素之一。目前，在肉鸡生产中，为了提高生产性能和免疫性能，生产厂家往往添加较高剂量的维生素A。然而，许多研究表明，维生素A过量是引起肉鸡钙磷代谢异常、骨骼发育不良及生长发育迟缓的原因之一[1-3],但关于过量维生素A对肉鸡钙磷代谢影响的机理研究很少。钙结合蛋白（CaBP）主要存在于鸟类的肠道组织中，有研究发现，小肠上皮细胞内CaBP含量与肠钙吸收量呈正相关，因此认为CaBP在禽类肠钙吸收过程中起重要作用（Bouhtiauy等，1994）[4]。骨钙素（BGP）是由成骨细胞合成的一种依赖于维生素K非胶原蛋白，存在于骨骼组织中。血液BGP含量与成骨细胞的活性呈正相关，与骨的形成有关，可作为骨形成的标志物（Demer，1992）[5]。维生素 D3在肝细胞微粒体和线粒体中25-羟化酶的作用下，生成25-(OH)D3。随后进入肾脏，在肾小管细胞线粒体的1-α羟化酶催化下，25-(OH)D3转化成维生素D的最终活性形式1,25-(OH)2D3，然后转运到肠道、肾脏或其它靶组织中，调节钙磷代谢。Metz等（1985）[6]的研究指出，给幼龄火鸡饲喂大剂量维生素A和正常剂量的维生素D3以后,火鸡出现类似佝偻病的症状；但在给火鸡饲喂大剂量维生素A的同时，饲喂大剂量的维生素D3，火鸡的骨骼生长基本正常，提示维生素D对维生素A具有一定拮抗作用，同时也说明维生素A过量对火鸡的骨骼发育是否产生负面影响，与维生素D的添加剂量有关。金久善等（1994）[7]的研究指出，乳牛口服大剂量的维生素A造成骨骼钙磷代谢的紊乱，与过量的维生素A对维生素D3的拮抗作用有关，结果表明，大剂量维生素A组的乳牛维生素D3的活性代谢产物25-羟维生素D3和1，25-二羟维生素D3的生成减少，进而影响钙磷代谢。此外，肉鸡的钙磷代谢过程还受到甲状旁腺激素（PTH）及降钙素（CT）等激素的调节（Meyer等，1992）[8]。维生素A过量对肉鸡钙磷代谢的影响可能与这些活性物质或激素的分泌发生改变有关，同时也与维生素D的添加剂量有关，但相关的研究报道极少。鉴于此，本论文在前期试验研究的基础上，通过研究维生素A、D对钙磷代谢相关激素水平的影响，进一步探讨过量维生素A对肉鸡骨骼代谢的影响机理，为科学确定日粮中维生素A、D的适宜添加量提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 饲养管理与基础日粮

试验鸡采用涂塑肉鸡笼单层笼养，鸡笼均采用红外线加热装置自动控温。试验鸡自由采食，自由饮水，按常规的免疫程序进行免疫。各组的试验条件均保持一致。每天观察鸡群精神状态，其余管理同肉鸡常规饲养管理。试验的基础日粮除维生素A、D按照试验设计添加外，其他营养成分均满足肉仔鸡的营养需要。基础日粮组成及营养水平详见表1。

表1 基础日粮组成及营养水平（风干基础）

1.2 试验动物及分组

试验选择8日龄健康艾维茵雄性肉鸡384只，随机分成16个处理组，每个处理3个重复组，每个重复组8只鸡。采用4×4完全随机试验设计，在基础日粮中分别添加不同剂量的维生素A、D构成试验日粮。其中维生素A设4个添加水平，分别为1 500、3 000、15 000和45 000 IU/kg日粮，维生素D设4个添加水平，分别为 500、1 250、2 500和5 000 IU/kg日粮，共构成16个处理组的试验日粮。

1.3 样本采集

试验进行至第35 d，早8：00，在每个重复组中随机抽取2只鸡，每处理6只，翅静脉采血10ml放置于普通采血管(非抗凝)中，在4℃下3000r/min离心制备血清，－20℃冷冻保存备用。

1.4 测试项目与方法

1.4.1 血清CaBP含量

血清CaBP含量采用放射免疫分析法(RIA)测定。测试仪器为GC-911-γ-放射免疫计数器(中国科技大学实业总公司生产)，检测试剂盒由美国Sigma公司提供。

1.4.2 血清BGP、CT含量

血清BGP、CT含量采用放射免疫分析法（RIA）测定。测试仪器为GC-911-γ-放射免疫计数器(中国科技大学实业总公司生产)，检测试剂盒由北京华英生物技术研所提供。

1.4.3 血清活性维生素D3与PTH含量

血清活性维生素D3与PTH含量采用放射免疫分析法（RIA）测定。测试仪器为GC-911-γ-放射免疫计数器(中国科技大学实业总公司生产)。活性维生素D3检测试剂盒由美国索灵(DIASORIN)公司提供，PTH检测试剂盒由美国实验室诊断系统DSL有限公司提供。

1.5 数据处理

试验数据利用SAS(SAS Institute，1998)软件的Anova法进行方差分析，Duncan氏法进行多重比较，同时对不同维生素A、D的日粮处理主效应分别进行一次线性回归和一元二次回归分析。以P＜0.05作为差异显著性判断标准，P＜0.10表示差异趋于显著。

2 结果与分析

2.1 维生素A、D对肉鸡血清CaBP、BGP含量的影响（见表2)

由表2可以看出，维生素A水平对血清CaBP含量无显著的影响（P=0.79），但回归分析统计结果表明，血清CaBP含量与日粮维生素A水平的增加剂量趋于显著的一次线性降低剂量依赖关系(P=0.092)，回归方程为 y=-3.652E-5x+32.21，R2＝0.82。式中，x 为日粮维生素A的添加量；y为血清CaBP含量。其中，以1 500、3 000 IU/kg维生素 A组较高，15 000 IU/kg维生素A组较低，45 000 IU/kg维生素A组最低。日粮维生素D及维生素A、D交互作用对血清CaBP含量无显著影响（P=0.57，P=0.72）。结果也表明，日粮维生素A水平对肉鸡血清BGP含量的影响趋于显著 (P=0.08)，其中，45 000 IU/kg维生素A组血清BGP含量最低，有明显低于1 500 IU/kg维生素A组的趋势。回归分析结果表明，随着日粮维生素A水平的增加，血清BGP含量呈现一定的一次线性降低趋势 (P=0.17)，回归方程为 y=-3.80E-6x+3.46，R2＝0.69。式中，x为日粮维生素A的添加量，y为血清BGP含量。日粮维生素D对血清BGP含量无显著影响(P=0.54)，但随着日粮维生素D水平的增加，血清BGP含量呈现一定的一次线性增加趋势 (P=0.14)，回归方程为y=3.69E-5x+3.34，R2＝0.74。式中，x为日粮维生素 D 的添加量，y为血清BGP含量。维生素A、D交互作用对血清BGP含量无明显的互作效应(P=0.67)。

表2 日粮维生素A、D对肉鸡血清CaBP、BGP含量的影响

2.2 维生素A、D对肉鸡血清CT、PTH及维生素D3含量的影响(见表3)

表3 日粮维生素A、D对肉鸡血清CT、PTH和VD3的影响

表3的结果表明，日粮维生素A、D水平及其交互作用对血清CT含量均无显著影响(P＞0.05)。但回归分析统计结果表明，随着日粮维生素A水平的增加，血清CT含量呈现一定的一次线性降低趋势(P=0.18)，回归方程为y=-0.21E-3x+128.73，R2=0.67。式中，x为日粮维生素A的添加量；y为血清CT含量。其中，1 500 IU/kg维生素 A组最高，3 000、15 000 IU/kg维生素A组较低，尤以45 000 IU/kg维生素A组最低。日粮维生素A水平对血清PTH含量虽然无显著的影响(P=0.20)，但回归分析统计结果表明，血清PTH含量随着日粮维生素A水平的增加而增加，并呈显著的一次线性(P=0.029)剂量依赖关系，回归方程为y=8.31E-5x+30.84，R2=0.94。式中，x为日粮维生素A的添加量，y为血清PTH含量。其中，15 000、45 000 U/kg维生素A组血清PTH含量较高，尤以45 000 IU/kg维生素A组最高。日粮维生素D水平及维生素A、D交互作用对血清PTH含量均无显著影响 (P=0.88，P=0.95)。

日粮维生素A水平对血清维生素D3含量无显著影响(P=0.87)。但回归分析统计结果表明，血清维生素D3含量随着日粮维生素A水平的增加而降低，并呈一定的一元二次(P=0.12)剂量依赖关系，回归方程为y=6.38E-9x2-3.57E-4x+37.66，R2=0.99。式中，x为日粮维生素A的添加量，y为血清维生素D3含量。日粮维生素D水平对血清维生素D3含量的影响趋于显著(P=0.08)，5 000 IU/kg维生素D组血清维生素D3含量较其它三组有显著增加趋势，2 500 IU/kg维生素D组血清维生素D3含量也较高；回归分析结果表明，血清维生素D3含量与日粮维生素D水平间呈现趋于显著的一次线性增加的剂量依赖关系(P=0.093)，回归方程为y=0.002 4x+30.07，R2=0.82。式中，x为日粮维生素D的添加量，y为血清维生素D3含量。维生素A、D交互作用对血清维生素D3含量无显著影响(P=0.42)。

3 讨论

3.1 日粮维生素A对肉鸡血清CaBP、BGP、CT、PTH及维生素D3含量的影响

很多资料研究得出，过量的维生素A可引起肉鸡钙磷代谢的紊乱。闫素梅等（2007）[2]、冯永淼等（2007）[3]的前期试验研究进一步验证了该结果，研究表明：日粮添加过量的维生素A（45 000 IU/kg）时，肉鸡胫骨强度显著降低，生长发育有显著的降低趋势；日粮添加临界过量的维生素A（15 000 IU/kg）时，胫骨钙含量、血清AKP活性有降低的趋势，胫骨磷含量升高，生长发育有显著的降低趋势；但关于其影响机理尚不十分清楚。CaBP主要存在于鸟类的肠道组织中，研究发现小肠上皮细胞内CaBP含量与肠钙吸收量呈正相关，因此认为CaBP在禽类肠钙吸收过程中起重要作用（Bouhtiauy等，1994）[4]。本试验结果显示，随着日粮维生素A水平的增加，血清CaBP含量呈趋于显著的一次线性降低趋势（P＜0.10）；其中，以 15 000、45 000 IU/kg维生素A组较低，45 000 IU/kg维生素A组对其降低效果更为明显。血清CaBP浓度的降低，可能会引起钙在肠道中的吸收受阻，进而引起骨骼钙磷代谢异常。关于维生素A过量引起血清CaBP浓度降低的机制尚不清楚。Matsumoto等（1998）[9]的研究发现，维生素A的中间代谢产物视黄酸参与依赖维生素D的CaBP基因表达。冯永淼（2007）[10]试验研究表明，随着日粮维生素A添加量的增加，十二指肠CaBP基因表达降低，当维生素A水平增加至15 000、45 000 IU/kg时，十二指肠的CaBP基因表达量有下降的趋势，提示日粮维生素A过量（15 000～45 000 IU/kg）时，可引起肉鸡的血清CaBP浓度降低，与其抑制了组织中CaBP基因表达有关，进而影响了钙磷代谢。

BGP又称骨依赖维生素K蛋白，主要由成骨细胞合成、释放，并分泌于骨基质中。血液BGP含量与成骨细胞的活性呈正相关，与骨的形成有关，可作为骨形成的标志物（Demer，1992）[5]。早期研究结果表明，BGP在骨骼生长、羟磷灰石沉积时增加，有利于骨骼的生长，在调节骨骼代谢中起着重要的作用[11]。本试验结果得出，维生素A过量组（15 000、45 000 IU/kg）的血清BGP含量呈显著的降低趋势。由此推断，日粮过量维生素A对肉鸡骨骼发育及钙磷代谢的负面影响与BGP的浓度降低进而影响骨骼的矿化过程有关。关于维生素A引起BGP浓度降低的机理研究尚不多见。陶天遵等（2005）[12]指出，维生素K是BGP中谷氨酸γ位羧化的重要辅酶，影响BGP的生物活性与生物合成。当日粮维生素K缺乏时，引起动物机体血清与骨骼中BGP的浓度下降，造成骨矿化过程不能进行(Iber，1989)[13]。夏兆飞（1997）[14]的研究结果表明，大剂量的维生素A抑制骨钙素（BGP）的合成，降低血清钙磷水平，造成肉鸡胫骨矿化不全，引起骨骼代谢异常。

CT是由甲状旁腺滤泡旁细胞分泌的一种活性激素，是动物体内调节钙磷代谢的重要激素之一。CT是强有力的骨吸收拮抗剂，破骨细胞上存在其受体，CT在几分钟内能迅速抑制破骨细胞的活性，长期则抑制其增殖，使破骨细胞数量减少，从而抑制骨吸收，降低骨转换，以降低血钙磷含量，对骨有保护作用（曹国凡等，2008）[15]。血 Ca2+是影响 CT分泌的主要因素，与 CT含量呈正相关。本试验结果表明，随着日粮维生素A水平的增加，血清CT含量呈一定的一次线性降低趋势，但关于其影响机理尚不清楚，相关的研究报道也少见。闫素梅等（2007）[2]的前期研究结果得出，随日粮维生素A水平的增加，血清钙含量呈显著的一次线性降低趋势，与本试验结果相吻合。提示，过量维生素A引起血清CT浓度降低与血钙含量的降低有关。提示，过量维生素A可降低血清CT的含量，与血钙含量的降低有关，即过量维生素A引起血清CT含量的降低是钙代谢紊乱的一种适应调节。

PTH是调节骨转换及骨骼钙磷代谢的最为重要的肽类激素之一。池肇春（1984）[16]研究报道，PTH的分泌及进入血液循环主要受血浆Ca2+浓度的调节，血钙含量低于正常水平促进PTH分泌，高于正常则抑制其分泌。闫素梅等（2007）[2]的研究结果得出，随日粮维生素A水平的增加，血清钙含量呈显著的一次线性降低趋势。本试验结果表明，随着日粮维生素A水平的增加，血清PTH含量呈显著的一次线性增加（P=0.029）；提示，过量维生素A引起血清PTH的浓度降低与血钙含量的降低有关，即过量维生素A引起血清PTH含量的增高是钙代谢紊乱的一种适应调节。

维生素D3必须经过两次酶促羟化阶段转化成为1，25-（OH）2D3才能具有生物活性。1，25-（OH）2D3在肠道、肾脏及骨骼中均具有调节钙磷水平的重要作用（朱建军等，2009）[17]，通过激活钙磷离子在肠上皮细胞的主动转运，增加钙磷吸收，提高血液钙磷水平，保证骨骼正常钙化。一些研究表明，过量维生素A对维生素D具有拮抗作用，维生素A到达消化吸收部位前，部分损坏维生素D，干扰了维生素D3的正常吸收和代谢(Metz等，1985；Veltmann 等，1985)[18-19]。金久善等（1994）[7]的研究指出，乳牛口服大剂量的维生素A造成骨骼钙磷代谢的紊乱，与过量的维生素A对维生素D3的拮抗作用有关，结果表明，大剂量维生素A组的乳牛维生素D3的活性代谢产物25－羟维生素D3和1，25－二羟维生素D3的生成减少，进而影响钙磷代谢。本试验结果表明，随日粮维生素A水平的增加，血清维生素D3含量呈一定的一元二次降低趋势，进一步验证了过量维生素A对维生素D的拮抗作用。由此推断，过量维生素A可能通过抑制维生素D的吸收，引起维生素D3水平的降低，进而影响钙磷的转运和骨骼的钙化，导致肉鸡钙磷代谢紊乱。

3.2 日粮维生素D对肉鸡血清CaBP、BGP、CT、PTH及维生素D3含量的影响

王松艳等（1999）[20]研究报道，缺乏维生素D的日粮可引起肉鸡体内活性代谢产物减少，血清钙磷含量降低，骨重吸收增加，骨密度、骨矿含量、股骨重等均低于正常组。闫素梅等（2007）[2]研究结果表明，日粮维生素D水平在500～5 000 IU/kg范围内，随着日粮中维生素D添加剂量的增加，血清钙磷含量呈一次线性增加趋势，胫骨钙含量呈显著的一元二次曲线上升趋势。本试验结果表明，日粮维生素D水平对肉鸡血清BGP及维生素D3水平的影响呈一定剂量依赖性，随日粮维生素D水平的增加，血清活性维生素D3含量呈趋于显著的一次线性增加趋势（P=0.093），血清BGP含量呈现一次线性增加趋势(P=0.14)，提示高剂量的维生素D水平对过量维生素A有弱的拮抗作用，可以缓解过量维生素A对骨骼代谢产生的不利影响。Metz等（1985）[6]的研究指出，给幼龄火鸡饲喂大剂量维生素A和正常剂量的维生素D3以后,火鸡出现类似佝偻病的症状；但在给火鸡饲喂大剂量维生素A的同时，饲喂大剂量的维生素D3，火鸡的骨骼生长基本正常，提示维生素D对维生素A具有一定拮抗作用，与本试验结果相似。

本试验结果也得出，日粮维生素A水平在1 500～45 000 IU/kg范围内，维生素D水平在500～5 000 IU/kg范围内，维生素A、D交互作用对肉鸡血清CaBP、BGP、PTH、CT及维生素D3含量的影响均不显著，但是相关的研究报道很少，确切的结果还有待于进一步的研究探讨。

4 结论

在本试验条件下，初步得出以下结论：

① 45 000 IU/kg维生素A组血清BGP含量最低，有显著低于1 500 IU/kg维生素A组的趋势(P=0.08)。日粮维生素A水平在1 500～45 000 IU/kg范围内，随着日粮维生素A水平的增加，血清CaBP含量呈趋于显著的一次线性降低趋势（P=0.092），维生素D3含量与CT浓度也呈一元二次降低趋势（P=0.12）及一次线性降低趋势（P=0.18），其中，以 15 000、45 000 IU/kg维生素A组较低，尤以45 000 IU/kg维生素A组最低，血清PTH含量呈显著的一次线性增加（P=0.029）。

②日粮维生素D水平在500～5 000 IU/kg范围内，随着日粮维生素D水平的增加，血清维生素D3含量呈趋于显著的一次线性增加趋势（P=0.093），血清BGP浓度也呈一次线性增加趋势（P=0.14）；其中，以2 500和5 000 IU/kg时较高，5 000 IU/kg时最高。

③过量维生素A引起的肉鸡骨骼钙磷代谢发生障碍与血清CaBP含量的降低及PTH浓度的增加有关，也与过量维生素A对维生素D的拮抗作用有关。

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